Este artigo descreve a gravação de células individuais de fluorescente etiquetado populações neuronais na retina do rato intacto. Usando dois fótons infravermelhos excitação transgenetically células marcadas foram alvo de patch-clamp de gravação para estudar as respostas de luz, as propriedades de campo receptivo, e morfologia.
Estudar as propriedades fisiológicas e conexões sinápticas de neurônios específicos no tecido intacto é um desafio para as células que evidente falta características morfológicas ou mostrar uma baixa densidade populacional. Isso vale principalmente para células amácrinas da retina, uma classe de interneurônios excepcionalmente multiformes que compõem cerca de 30 subtipos em mamíferos 1. Apesar de ser uma parte crucial do processamento visual, moldando a saída da retina 2, a maioria desses subtipos não foram estudadas até agora em um contexto funcional, pois encontrar essas células com um eletrodo de gravação é um evento raro.
Recentemente, uma infinidade de linhas de camundongo transgênico que está disponível marcadores fluorescentes expressar como a proteína verde fluorescente (GFP) sob o controle de promotores de receptores de membrana ou enzimas que são específicos para apenas um subconjunto de neurônios em um dado tecido 3,4. Estas células pré-rotulados são, portanto, accessible para microeletrodo dirigido segmentação sob controle microscópico, permitindo o estudo sistemático de suas propriedades fisiológicas in situ. No entanto, a excitação de marcadores fluorescentes é acompanhada pelo risco de fototoxicidade para o tecido vivo. Na retina, esta abordagem é adicionalmente prejudicada pelo problema que a luz de excitação faz com que a estimulação adequada dos fotorreceptores, assim, infligir fotopigmento branqueamento e transferência dos circuitos da retina em uma condição de luz adaptado. Estas desvantagens são superadas usando excitação infravermelho entregue por um mode-locked laser em pulsos curtos da faixa de femtossegundos. Excitação de dois fotões fornece energia suficiente para a excitação fluoróforo e, ao mesmo tempo restringe a excitação a um pequeno volume de tecido a minimização dos perigos de photodamage 5. Além disso, ele deixa a retina sensíveis aos estímulos visuais desde a luz infravermelha (> 850 nm) só é mal absorvido pelo fotopigmentos 6.
<p class = "jove_content"> Neste artigo, vamos demonstrar o uso de uma retina de camundongos transgênicos para atingir eletrofisiológico em gravações situ de células que expressam GFP que são visualmente alvo de dois fótons excitação. A retina é preparada e mantida no escuro e pode ser submetido a estímulos ópticos, que são projetadas através do condensador do microscópio (Figura 1). Patch-clamp gravação de respostas a luz pode ser combinado com a tintura de enchimento para revelar a morfologia e para verificar se há corante gap-junction mediada acoplamento para as células vizinhas, de modo que a célula-alvo pode por estudadas em diferentes níveis experimental.Este método oferece a possibilidade de estudar as propriedades elétricas de neurônios específicos na retina intacta sob orientação visual, sem influenciar a condição de adaptação da retina. É particularmente adequado para a caracterização de células que estão actualmente bastante mal estudada, devido à baixa densidade populacional como a maioria das populações de células amácrinas. Dois fótons excitação permite imagens de alta resolução e alto contraste até mesmo de partes mais profundas do tecido 17, um pré-requisito para uma mira precisa e bem sucedida patch-fixação de células particularmente no INL, com sua alta densidade de corpos celulares.
A retina do rato isolada é viável para 3-4 h nas condições experimentais. Se a retina segundo é armazenado em completa escuridão sob gaseamento carbogênio contínua, mantém a cor púrpura do fotopigmento crus e pode ser usado depois de terminar experimentos com a retina em primeiro lugar. No início, visando acélulas selecionado com a micropipeta na wholemount da retina é um pouco desafiador e requer alguma prática, especialmente quando se trabalha na escuridão. Incluindo um corante fluorescente na micropipeta pode simplificar o procedimento, porque celular e micropipeta são visíveis sob dois fótons de excitação, ao mesmo tempo. No entanto, a adição de componentes à solução intracelular podem impedir a formação de gigaseal ou causar a qualidade de gravação a sofrer. Uma vez alcançado com sucesso, uma boa gravação pode durar cerca de 1 h.
Considerando que a luz de excitação infravermelho si só é mal absorvido por fotorreceptores da retina, animado células que expressam GFP emite luz na parte visível do espectro. No entanto, fluoróforos está animado apenas em um pequeno volume focal que não é susceptível de alterar a condição de adaptação da retina. Ainda mais excitação, só é necessária para segmentação e pode ser desligado durante a gravação de respostas luz.
O usefulness desta abordagem já está demonstrada por estudos em populações específicas de células amácrinas 14,18 a partir do qual as gravações eletrofisiológicas de outra forma teria sido possível apenas por acidente 12. Finalmente, esta poderosa técnica pode ainda ser prorrogado, incluindo uma abordagem farmacológica 14, Ca 2 + 19 ou imagem usando células injetadas para estudos imunocitoquímicos ou microscopia eletrônica. Dessa forma, a posição funcional de um dado tipo de célula no circuito da retina podem ser desvendados.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (WE849/16 1 / 2 a KD e RW). Estamos gratos ao Euler Thomas (Töbingen, Alemanha) para o software QDS luz estimulação.
Reagent/Equip-ment | Company | Catalogue number | コメント |
---|---|---|---|
Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
Optical filter | Schott, Mainz, Germany | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
Recording chamber | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
Flow heater | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
Air table | Newport | VH 3036W-OPT | |
Laser | Spectra-Physics | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
Micromanipulator | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
Patch-clamp amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-05LX npi | |
Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm | |
Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |