이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 – 클램프 녹음 대상으로했다.
생리적 속성과 손상 조직에서 특정 뉴런의 시냅스 연결을 공부하는 것은 눈에 형태학의 기능이 부족하거나 낮은 인구 밀도를 보여 이들 세포에 대한 도전이다. 이것은 특히 망막 amacrine 세포, 포유류 1 약 30 subtypes을 구성 interneurons의 매우 여러 가지 모양의 클래스에 적용됩니다. 기록 전극 이러한 세포가 발생하는 것은 드문 경우이기 때문에 망막 출력 2 형성하여 영상 처리의 중요한 부분이되고 있지만, 이러한 subtypes의 대부분은 지금 기능 맥락에서까지 연구되지 않았습니다.
최근 유전자 변형 마우스 라인의 다수가 사용할 수 막 수용체 또는 특정 조직 3,4에서 뉴런의 하위 집합만와 관련된 효소에 대한 발기인의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)와 같은 표현 형광 마커. 이러한 사전 분류 전지 따라서 accessibl 아르현장에서 생리 속성의 체계적인 연구를 허용, 미세한 통제 대상으로 이동 microelectrode 전자. 그러나, 형광 마커 여기는 살아있는 조직에 대한 phototoxicity의 위험이 동반됩니다. 망막에서이 접근 방법은 또한 여기 빛이 따라서 photopigment을 가하 표백하고 가벼운 적응 상태로 망막 회로를 전송, photoreceptors의 적절한 자극을 일으키는 문제로 방해합니다. 이러한 단점은 femtosecond 범위의 짧은 펄스의 모드 잠금 레이저로 전달되는 적외선 여기를 사용하여 극복할 수 있습니다. 두 광자 여기는 형광단에 여기에 대한 충분한 에너지를 제공하고 동시에 photodamage 5 위험을 최소화 작은 조직 볼륨 여기를 제한합니다. 적외선은 (> 850 nm의) 만 제대로 photopigments 6 흡수되기 때문에 또한, 그것은 시각적 자극에 반응하는 망막을 떠납니다.
<p clas이 문서에서 s = "jove_content"> 우리가부터 현장 레코딩에 electrophysiological 달성하기 위해 유전자 변형 마우스 망막의 사용 보여줍니다 GFP를 표현하는 시각 두 광자 여기에 의한 타겟 세포를. 망막은 준비하고 어둠 속에서 유지 관리 및 현미경의 콘덴서 (그림 1)를 통해 예상 아르 광학 자극을 받다 수있다. 빛의 반응 패치 – 클램프 녹음 염색은 형태를 공개하여 대상 세포에 의해 다른 실험적인 수준에서 공부를 할 수 있도록 이웃 세포에 결합 간격 접합 – 중재 염료를 확인하기 위해 작성과 함께하실 수 있습니다.이 방법은 망막에 adaptational 상태에 영향을 미치는없이 영상지도하에 손상 망막에서 특정 뉴런의 전기적 특성을 연구하기위한 가능성을 제공합니다. 그것은 특히 다소 저조한 amacrine 세포의 대부분의 인구와 같은 낮은 인구 밀도로 인해 공부를 현재에있어 세포의 특성에 적합합니다. 두 광자 여기도 조직 17 깊은 부분, 정확한 타겟팅을위한 전제 조건과 성공적인 패치 – 클램핑 특히 세포 기관의 높은 밀도와 INL의 세포.에서 높은 해상도와 높은 명암 영상을 허용
분리된 마우스 망막의 실험 조건 하에서 3-4 H를 위해 가능한 것입니다. 두 번째 망막이 지속 carbogen의 가스 하에서 완전한 어둠에 저장되어있다면, 그것은 표백하지 않은 photopigment의 보라색 색상을 유지하고 처음으로 망막과 실험을 마치신 후 사용할 수 있습니다. 처음에는,를 대상으로망막 wholemount에 micropipette과 선택한 셀 어둠에서 근무 특히, 약간의 도전이며 연습이 필요합니다. 셀 및 micropipette가 동시에 두 광자 여기 아래에 표시되기 때문에 micropipette에 형광 염료를 포함시키는 것은 절차를 간소화하실 수 있습니다. 단, 세포내 솔루션 구성 요소를 추가하면 gigaseal 형성을 방해하거나 녹음 품질이 고통의 원인이 될 수 있습니다. 일단 성공적으로 달성, 좋은 녹음은 약 1 H. 지난 수
적외선 여기 가벼운 반면, 자체에만 제대로 망막 photoreceptors에 의해 흡수, 흥분 GFP – 표현 스펙트럼의 보이는 부분에 세포가 빛을 방출. 그러나, fluorophores은 망막의 adaptational 조건을 변경할 가능성이없는 작은 초점 볼륨에 흥분하고 있습니다. 모든 더 여기는 타겟팅에 필요한 빛과 반응 녹화 중에 꺼질 수 있습니다.
usefuln이 방법의 ESS는 이미 electrophysiological 녹음이 달리 오직 사고 12 가능했을있는 amacrine 세포 14,18의 특정 인구에 대한 연구에 의해 입증됩니다. 마지막으로,이 강력한 기술은 더욱 약리 접근 14, CA 2 + 영상 19를 포함하거나 immunocytochemical 연구 또는 전자 현미경에 대한 주입 세포를 사용하여 확장할 수 있습니다. 그 방법은, 망막 회로에 주어진 세포 유형의 기능적 위치 풀어하실 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (KD와 RW에 WE849/16 1 / 2)에 의해 지원되었다. 우리는 빛의 자극 소프트웨어 QDS에 대한 토마스 오일러 (Töbingen, 독일)에 감사하고 있습니다.
Reagent/Equip-ment | Company | Catalogue number | コメント |
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Night-vision goggles | Gutzeit GmbH, Warthausen, Germany | Xtron F1 | includes a 800 nm light source |
Optical filter | Schott, Mainz, Germany | RG9 | longpass filter with cutoff at 690 nm |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14061-09 | curved with 22 mm blade |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | straight with 3 mm blade |
Recording chamber | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 200-100 500 0180 type A(TC) | Teflon chamber with bottom-mounted glass cover slip (approx. 0.15 mm; No. 200-100 500 0182) |
Flow heater | Multichannel Systems, Reutlingen, Germany | PH01, TC01 | heatable perfusion cannula with temperature sensor and temperature controller |
Laser scanning microscope | Leica Microsystems | DM LFS | controlled by Leica Confocal Software |
Air table | Newport | VH 3036W-OPT | |
Laser | Spectra-Physics | Tsunami Mode-locked Ti:sapphire laser | |
CCD camera | pco AG, Kelheim, Germany | PixelFly QE | including control software |
Micropipette glass capillaries | Hilgenberg, Malsfeld, Germany | 1408411 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-20004 | fluorescent dye |
Neurobiotin | Axxora | VC-SP-1120-M050 | non-fluorescent tracer |
Streptavidin-Cy3 | Dianova | 016-160-084 | |
Micromanipulator | Luigs & Neumann GmbH, Ratingen, Germany | 210-100 000 0010 | motorized Mini25 manipulator unit with display SM-5 |
Patch-clamp amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-05LX npi | |
Digitizer | National Instruments | BNC-2090 | |
Data acquisition software WinWCP | John Dempster, University of Scotland, Glasgow, UK | http://spider.science.strath. ac.uk/sipbs/ software.htm | |
Visual stimulus generator QDS | Thomas Euler, University of Tübingen, Germany | has to be operated on a separate computer controlling 2 monitors (user interface, stimulus monitor) | |
Neutral density filters | ITOS, Mainz, Germany |