在完整的视网膜电生理特性表达GFP的细胞群

以下说明假设实验者有一个基本的了解视网膜结构，膜片钳记录和双光子显微镜。建立和运行一个设置膜片钳和双光子成像系统的有用信息，请参阅文献[7-12]。 1。动物和组织准备保持鼠标暗适应至少3小时。在此期间，准备1-2升胞组成的解决方案（毫米）125 2.5氯化钠，氯化钾，氯化钙，1.6 MgCl 2的，25日10碳酸氢钠3，D -葡萄糖和平衡pH值7.4 carbogen毒气（5％CO 2在O 2）在室温下。 一 二氧化碳过量颈椎脱位，安乐死在气密腔的鼠标。此过程，并应在黑暗中进行以下步骤。使用昏暗的长波长的光照（我们阻止短的波长由690纳米longpas的冷光源的过滤器），以支持个人愿景，同时保持动物的眼睛暗适应（小鼠只有在光谱的红色部分视力不佳）。在完全黑暗的使用红外线照明（> 800 nm的）的工作，并佩戴夜视镜。 Enucleate眼用一双弯曲的虹膜剪刀和他们转移到一碟放置在解剖显微镜下的细胞外液。 开放与对春天的剪刀（我们第一次使用柳叶刀刺穿切割为起点）沿锯齿缘（视网膜及睫状体之间的边界）的眼球中取出的角膜和睫状体。取出镜头，仔细分离的视网膜色素上皮细胞。如果视网膜的方向是对你的学习至关重要，表明它像文献[12]。切断视神经和视网膜色素上皮之间，视网膜除去眼罩。注意视网膜表面的方向：卷曲的视网膜内的gangl离子电池的一面;外感光方。 删除玻璃体视网膜内层表面轻轻拉出一个木制牙签援助。为了这个目的，使用了细胞外液的体积小，只是涵盖的视网膜。视网膜玻璃体支牙签，可以拖动离心关闭。然后，应用短切口，沿视网膜的周边，以方便扁平化的组织。 转移到录音室视网膜感光的一面朝下，宣扬出去的玻璃底部（我们使用细刷）和固定的不锈钢尼龙串成帧。第二视网膜准备以同样的方式，并保持它在carboxygenated供日后使用外液暗适应。 2。录音一个堂堂正正的激光扫描显微镜下安装在黑暗的录音室，并不断superfuse视网膜准备（不低于5毫升/公里n与细胞外液carboxygenated）加热到35 ° C。显微镜（还配备一个红外敏感CCD相机）坐落在一个吸震内的电子屏蔽法拉第笼的空气表。与非透明幕墙笼盖，继续在黑暗中准备。红色透明薄膜，我们还从电脑显示器屏幕关闭。 850-870 nm或更长的波长调谐红外激光，切换到锁模条件，并使用双光子激发可视化表达GFP的细胞。衰减激光的输出控制激光扫描软件在一定程度上的荧光细胞清楚地认识到，这只是足够使用中性密度过滤器对于膜片钳记录，电流钳模式使用玻璃微量（我们用硼硅玻璃管材外径1.5毫米和0.225毫米壁厚）洋溢着细胞内组成的解决方案（毫米）125 K -葡萄糖酸，氯化钾10 0.5 EGT，10 HEPES，与氢氧化钾（给人一种吸管约5MΩ电阻）滴定至pH 7.4。请注意电压钳记录等其他实验条件下，需要不同的解决方案。如果需要注射染料，加入荧光探针（我们使用10毫米的Alexa Fluor 594）或示踪分子（3％Neurobiotin）。微管插入持有人，确保参比电极（氯化银线）与细胞外液在录音室接触。 施加压力的微量和目标的GFP表达细胞（我们用40倍水浸泡的目的; NA 1.25）。坐落在神经节细胞层（直接在视网膜的电流方向表面之下）在内核层的近端部分（编制内深约55-75微米），以及无长突细胞组织。微量的靶细胞，内界膜（胶质endfeet鞘）在视网膜接触前表面有被击穿。是公认的成功渗透赶出从微管尖和分离从底层的视网膜组织内界膜红外线传输IR – CCD相机拍摄的图像上，可以观察细胞内的解决方案。 办法从双光子图像进行比较SOMA的位置与图片的IR – CCD相机，记录微量的位置所需的细胞。请注意，这一步是不容易实现，需要一定的练习，因为绿色荧光蛋白表达细胞在确认以直接的微量红外线传输图像。正确的定位是实现时，微管尖端导致细胞表面可以看到在双光子图像的凹陷。替代此过程中，使用荧光染料在细胞内的解决方案（例如的Alexa Fluor 594，100微米），以揭示在双光子图像的微量位置。红外双光子激发允许足够的这种染料的荧光微量明显。为此，调整激光扫描软件，还包括红色荧光的检测范围。 从微量释放的压力，并获得一个全细胞膜片钳配置在电流钳模式。一个可用的录音应该给的-50至-55 mV的膜电位和持续至少20分钟。 目前创建一个刺激软件（我们使用，德国蒂宾根大学的托马斯欧拉，量子点），在计算机显示器上11的视觉刺激。调整要记录的细胞刺激的空间位置是：马克显示器上显示的IR – CCD相机和中心到它的一个斑点状的刺激传输图像的细胞位置。中性密度​​滤光片插入光路中的调整刺激强度。校准显示器的频谱和强度，见参考文献[14]。选择一个prolongeð刺激间隔（如15秒），以避免适应。包括一个光电二极管保持在光束路径上的刺激定时记录。 启动刺激的协议，并记录光响应（我们使用与非尖峰细胞过滤5 kHz时为10 kHz的采样率;穗录音建议像更高的采样率20千赫）。使用光刺激软件触发录音软件。 染料充填让前仔细回缩荧光剂扩散到30-45分钟的记录细胞从细胞的微管。小心不拉细胞体。如果使用非荧光示踪Neurobiotin，它需要通过有约束力的可视化链霉亲和共轭一个荧光团（我们在夜间使用链霉亲和素- Cy3标记，1:400 4 ° C，经过20分钟的视网膜多聚甲醛固定;染料耦合研究链霉亲和孵化，可以延长至3天）。另外，注射剂也可以进行与尖锐的电极（> 100MΩ）当染料驱动iontophoretically刺穿细胞（矩形脉冲：0.25-1 NA，100毫秒，间隔100毫秒，总时间3-6分钟）。 3。代表性的成果： 以下结果来自对鼠标的研究表达绿色荧光蛋白（GFP）启动子下，儿茶酚胺合成的限速步骤（TH：GFP的小鼠）的酶催化酪氨酸羟化酶 13,14 。基于GFP信号的两个不同的细胞群的亮度分辨（图2A）。细胞中表达的GFP水平较高，拥有位于内核层（INL，图2A），或在神经节细胞层（保利协鑫，图2B）流离失所的胞体和内网状层中的分层（图2C，彩光） 。他们被确定为2型细胞14-16的形态（图3）可以系统地进行研究，并选举rical活动（图4），即使它的人口密度仅为250细胞/毫米2。 图1。实验装置示意图。双光子激发（红色点缀光路）荧光团，表达完整的视网膜细胞，使视觉由微管（绿色发射光路）的目标。通过冷凝器显微镜（黄色光路）预计的光刺激，视网膜细胞对光反应记录。 图2。绿色荧光蛋白表达细胞在视网膜的一个TH flatmount：GFP的鼠标。可以区分两类人群的GFP信号的亮度：1型细胞（DA细胞）位于显示弱荧光（A，见箭头）的INL和强烈的标记2型细胞INL（A，见箭头）或在保利协鑫（B）和树突状分层阶层的IPL S3（三）在流离失所的细胞体。比例尺，50微米。 图3 2型细胞注射示踪Neurobiotin的形态。示踪剂后来可视化链亲和素- Cy3标记的绑定（洋红色）。的显微照片，这也是描绘的GFP信号（绿色），是一个覆盖GCL和IPL的形象栈的投影。比例尺，50微米。 图4。位于保利协鑫2型细胞对光反应。在暗的范围内增加强度的照明白光满场的响应模式。刺激强度是每秒每杆（RH * /棒/ S）photoisomerizations。用于更好的不同的是一个3秒的长时间刺激离子刺激发病响应元件（ON响应）和偏移量（OFF响应）。