Murine Oberflächliche Lymphknoten Chirurgie
概要
Um den Verlauf einer Immunantwort im Laufe der Zeit innerhalb der gleichen Maus folgen, können Lymphknoten sequentiell durch eine Operation entfernt werden. Hier beschreiben wir, wie diese Technik durchgeführt werden kann.
Abstract
Auf dem Gebiet der Immunologie, um das Fortschreiten einer Immunantwort gegen ein Impfstoff, einer Infektion oder eines Tumors zu verstehen, wird die Antwort oft über die Zeit verfolgt. In ähnlicher Weise erfordert die Untersuchung von Lymphozyten Homöostase Zeitverlauf Experimenten. Durchführung dieser Untersuchungen innerhalb der gleichen Maus ist ideal, um die experimentellen Variabilität sowie die Anzahl der Mäuse zu verringern. Blutentnahmesystem ermöglicht Leistung Zeitverlauf Versuche, aber es gibt nur Informationen über zirkulierenden Lymphozyten und eine begrenzte Anzahl von Zellen 1-4. Da Lymphozyten durch den Körper zirkuliert und die ihren Wohnsitz in den Lymphknoten unterschiedliche Eigenschaften haben, ist es wichtig, beide Standorte zu untersuchen. Die sequentielle Entfernung der Lymphknoten durch eine Operation bietet eine einzigartige Gelegenheit, um eine Immunantwort oder Immunzellen Expansion in der gleichen Maus über die Zeit zu folgen. Darüber hinaus liefert diese Technik zwischen 1-2×10 6 Zellen pro Lymphknoten, die ausreicht, EWrform phänotypischen Charakterisierung und / oder funktionellen Assays. Sequential Lymphknoten Operation oder Lymphadenektomie wurde erfolgreich von uns und anderen 5-11 verwendet. Hier beschreiben wir, wie die brachialen und inguinalen Lymphknoten indem Sie einen kleinen Schnitt in der Haut eines anästhesierten Maus entfernt werden kann. Seit der Operation ist oberflächlich und schnell erledigt, die Maus sehr schnell erholt, heilt gut und nicht die Erfahrung, übermäßige Schmerzen. Alle zwei Tage, ist es möglich, ein oder zwei Lymphknoten Berücksichtigung Zeitverlauf Versuche ernten. Diese Technik eignet sich somit, um die Eigenschaften von Lymphknoten-Lymphozyten Wohnsitz im Laufe der Zeit zu untersuchen. Dieser Ansatz ist geeignet, um verschiedene experimentelle Designs und wir glauben, dass viele Labors würden von der Durchführung sequentieller Lymphknoten-Operationen profitieren können.
Protocol
Discussion
Wir haben ein Protokoll von LN Operation, die zu vielen experimentellen Systemen anwenden können, beschrieben. Obwohl sehr nützlich, um Immunantworten oder Immunzellen Homöostase zu folgen, hat diese Technik einige Einschränkungen. Erstens kann nur vier LNs geerntet werden. Zweitens muss die Immunantwort untersucht werden systemische oder treten in den oberflächlichen Leisten-oder Arm-(Haut-Entleerung) LNS. Schließlich wird die Anzahl der Zellen geerntet von der Qualität des LN Entfernung, eine technische Beschr?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Sylvie Lesage und alle Labor-Mitglieder für die kritische Durchsicht des Protokolls. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (MOP-77545) von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt. Nathalie Labrecque wird durch ein Stipendium unterstützt FRSQ Senioren und Mélissa Mathieu erhielt eine NSERC Alexander Graham Bell Kanada Graduate Scholarship.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalog number | コメント |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Schering-Plough | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Boniche Animal Healthcare | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | ABBOTT | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis Ophtalmics | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega | L0000017 | DIN: 02251477 |
参考文献
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
