概要
Para seguir a progressão de uma resposta imune ao longo do tempo dentro do mesmo rato, gânglios linfáticos pode ser sequencialmente removido por cirurgia. Aqui, nós descrevemos como esta técnica pode ser realizada.
Abstract
No campo da imunologia, para compreender a progressão de uma resposta imunitária contra uma vacina, uma infecção ou um tumor, a resposta é muitas vezes seguida ao longo do tempo. Do mesmo modo, o estudo da homeostase de linfócitos, requer a realização do curso de tempo. Realização destes estudos, dentro do mesmo rato é ideal para reduzir a variabilidade experimental, bem como o número de ratinhos utilizados. Retirada de sangue permite realização de experimentos do curso de tempo, mas ele só dá informações sobre linfócitos circulantes e fornece um número limitado de células 1-4. Uma vez que os linfócitos circulam pelo corpo e que residem nos gânglios linfáticos têm propriedades diferentes, é importante examinar ambos os locais. A remoção sequencial de nódulos linfáticos por cirurgia proporciona uma oportunidade única para seguir uma resposta imune ou expansão de células imunes no mesmo rato ao longo do tempo. Além disso, esta técnica produz entre 1-2×10 células por 6 nó de linfa que é suficiente para perform caracterização fenotípica e / ou ensaios funcionais. Cirurgia nó de linfa ou seqüencial linfadenectomia foi usada com sucesso por nós e outros 5-11. Aqui, nós descrevemos como os nódulos linfáticos inguinais braquial e pode ser removido através de uma pequena incisão na pele de um rato anestesiado. Desde a cirurgia é superficial e feito rapidamente, o mouse se recupera muito rapidamente, é que cura bem e não sentir dor excessiva. Cada segundo dia, é possível colher um ou dois nódulos linfáticos, permitindo para experiências de curso de tempo. Esta técnica é portanto adequado para estudar as características de nódulo linfático que residem linfócitos ao longo do tempo. Este método é adequado para vários projetos experimentais e acreditamos que muitos laboratórios se beneficiariam de realização de cirurgias seqüenciais nó de linfa.
Protocol
Discussion
Nós descrevemos um protocolo de cirurgia LN que pode ser aplicado a muitos sistemas experimentais. Embora muito útil para acompanhar as respostas imunes ou homeostase de células imunes, esta técnica tem algumas limitações. Em primeiro lugar, apenas quatro LNS pode ser colhido. Em segundo lugar, a resposta imune deve ser estudada sistémica ou ocorrer nas inguinais superficiais ou braquial (pele de drenagem) LNS. Finalmente, o número de células colhidas é influenciada pela qualidade da remoção LN, uma limitaç…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Sylvie Lesage e todos os membros do laboratório para a leitura crítica do protocolo. Este trabalho foi financiado por uma subvenção (MOP-77545) do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque é apoiado por uma bolsa de estudos FRSQ Sênior e Mélissa Mathieu recebeu um NSERC Alexander Graham Bell Canada Bolsa de Pós-Graduação.
Materials
| Reagent Name | Company | Catalog number | コメント |
| Graefe Fine Pattern Premium Forceps | Harvard Apparatus | 52-2144 | Strongly Curved, 10 cm (4 in), 0.8 mm tip |
| Michel Clip Applying and Removing Forceps | Harvard Apparatus | 52-3779 | 12.5 cm (5 in) |
| Michel Clip 100 | Harvard Apparatus | 52-3746 | 7.5-1.75 mm |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Schering-Plough | ||
| Vetalar (Ketamine hydrochloride) | Boniche Animal Healthcare | DIN: 01989529 | |
| Rompun (Xylazine) | Bayer | DIN: 02169592 | |
| Isoflurane | ABBOTT | DIN: 02032384 | |
| Hypotears eye ointment | Novartis Ophtalmics | DIN: 02133288 | |
| Baxedin (Clorhexidine gluconate 2% in isopropyl alcohol 70%) | Omega | L0000017 | DIN: 02251477 |
参考文献
- Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
- Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
- Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
- Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
- Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
- Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
- Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
- Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
- Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
- Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
- Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
- Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
- Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).
