microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

1. 마이크 로칩 제조 SU8 마스터 제작. 30 S.를위한 3,000 RPM에서시 웨이퍼 40 μm의 높이, 스핀 코트 SU8 – 50 (MicroChem 주식 회사)의 microfluidic 채널을 얻으려면 65 핫 접시에 부드러운 빵을 ° 5 분, 95 C ° C 용매를 증발하고 필름을 densify 30 분. 아래로 냉각 후, SU8가 적절한 마스크 아래에 300 MJ / 2에서 360-440 nm의 방사와 저항 노출. 다음 노출, 65에서 웨이퍼를 구워 ° 사분 2 분 95 ° C에 대한 C. 냉각 후, 감동과 함께, 5 분 unexposed 영역을 (Micrpoposit EC 용제, Chestech) 개발 5. 사용하여 신선한 웨이퍼를 씻어하고 깨끗한 표면을 생성하는 가스에 따라 그것을 건조 용매 EC. 헥산 및 메탄올 세척과 웨이퍼를 처리합니다. 표면에 실란 trichloro 증발의 마지막 단계 (1,1,2,2 – perfluoocytl) (40 분 건조기)와 SU8 마스터 제조 과정을 완료하십시오. PDMS curinG, 다이싱 및 홀 – 펀칭. 구조 microfluidic 기판을 형성하기 위해, 우리는 마스터를 통해 부어 다음 crosslinker에 수지 10시 1분 (W / W) 비율 Sylgard 184 (다우 코닝)을 혼합합니다. 다음 건조기에서 가스를 제거하다, 그리고 65 한 시간 동안 장치 (위 계층)을 치료 ° C. 마스터에서 치료 PDMS와 껍질을 잘라. 생검 펀치를 사용하여 유체 튜브에 대한 액세스 구멍을 만듭니다. 65 20 분 동안 PDMS의 또 다른 계층 (균등 10×10 cm 배양 접시에 확산 수지 8 G) ° C. 치료 하단의 레이어에 준비 상위 레이어를 삽입하고 65 하룻밤 치료 ° C. 사용하기 위해 페트리 접시와 주사위에서 칩 껍질. 2. 실험 설정 Microfluidic 설정 기포가가 튜브의 부분에 남아 있도록, 필요한 솔루션 주사기를 (Beckton, 디킨스와 회사 또는 SGE 분석 과학에서 플라스틱이나 유리) 입력합니다. 비말 생성을위한 두 단계가 사용됩니다. 수성 (분산) phasE는 관심의 시약 (예 : 성장 매체 세포의 정지, 또는 분자 fluorophores의 솔루션)이 포함되어 있습니다. 이 경우 지속적인 단계 역할을 석유 단계는 일반적으로 기름과 계면 활성제의 혼합물, 플루오르 기름의 예 2 % 레인 댄스 계면 활성제 (레인 댄스 기술) (3M Fluorinert 전자 액체 FC – 40)에서 형성, 또는 2% 스팬 미네랄 오일 80 (Croda). 바늘 한 끝에 주사 바늘 팁과 같은 내부 직경의 튜브 (폴리에틸렌 튜브, 하버드 장치)를 맞습니다. 튜빙은 vibrational perturbations로 인한 흐름 불안정을 최소화하기 위해 가능한 최단 길이로 절단한다. 직접 PDMS 기판에 구멍 뚫은 구멍으로 튜브의 다른 쪽 끝을 연결합니다. 이러한 실리카 모세관 포트 또는 커넥터 (예 : Upchurch의 Nanoports)의 사용으로보다 복잡한 솔루션은 또한 microfluidic 장치와 튜브 사이에보다 강력한 인터페이스를 구현할 수 있습니다. 콘센트를 연결수집 (폐기물 수집 또는 추가 analyte 처리)로 튜브와 직접하는 칩의 포트. 주사기 펌프 (예 : PHD 4400 Hpsi 프로그램 주사기 펌프, 하버드 장치)에 주사기를 탑재하고 각 단계 (보통 분당 microliters의 주문)에 대한 원하는 일으키는 흐름 속도를 정의합니다. 1 오일 / 수성 흐름 요금의 최소 비율은 불안 정한 비말 형성 (장치 기하학에 따라 다름)로 이어질 것입니다 수성 단계에 의해 PDMS의 젖음을 방지하는 것이 좋습니다. 같은 이유로, 그것도 처음 수성 단계의 도입 전에 모든 microfluidic 채널을 통해 혼자 기름 단계를 플러시하는 것이 좋습니다. 실험에 본에 사용되는 최종 설정은 그림 2A에서 그림입니다. 광학 시스템 설치 높은 공간과 시간적 해상도 microfluidic 채널 내의 작은 볼륨 (아래 몇 picoliters)를 탐사하려면 공촛점 현미경 (자동 판매기와 함께 사용에드 submicron 위치 용량). 이상 높은 양자 수율로 수용성 형광 분자를 사용합니다. 관련 형광단의 흡수와 일치하는 파장의 레이저 작동을 사용하여 분자를 자극. 예를 들어, 플루오레신 5 isothiocyanate (FITC)와 알렉사 – 형석 488과 같은 일반적인 형광 분자가 효율적으로 488 NM 다이오드 레이저 (예 : PicoQuant GMBH, LDH – PC – 485)를 사용하여 흥분하실 수 있습니다. 같은 텍사스 레드 Allophycocyanin (APC)로 형광 분자가 효율적으로 사용하여 633 nm의에서 나온 수있는 그 / Ne 레이저 (예 : 뉴 포트 R – 31425). 반복 몇 MHz 이상의 속도 (여러 NS 펄스 분리)와 형광 수명 이미징 (FLIM) 실험 충분히 차별화된 평생 특성 fluorophores에서 운영 펄스 레이저를 사용합니다. 빔 높이뿐만 아니라 빔 방향을 제어 빔 – 스티어링 거울과 광학을 사용합니다. 목적 리터에 레이저 광선을 반영하기 위해 이색성 거울을 사용팔. 이 레이저를 동시에 사용할 경우, 듀얼 밴드 이색성 거울은 두 레이저 빔 (채도 기술 공사에서 z488/633rdc 미러 이상적입니다 488과 633 nm의 광선에 대한 예)의 반사를 허용하도록 설치할 수 있습니다. microfluidic 채널 내의 꽉 초점 레이저 빛을 가지고 무한대 – 수정, 높은 수치 개구 (NA) 현미경의 목적 (예 : 올림푸스 60 X / 1.2 NA, 물 침수)을 사용합니다. 키 microchannels (> 100 μm의) 작업을 할 때 사용하는 목적은 적절하게는 작동 거리가 효과적으로 microchannel의 전체 높이를 포함하도록 선택해야합니다. 같은 높은 NA 목표와 같은 이색성 거울을 통해 전송을 사용하여 샘​​플 (microfluidic 채널 이내)에 의해 방출되는 형광을 수집합니다. 싱글 또는 듀얼 밴드 방출 필터를 (예 : 채도 기술 공사에서 z488/633 필터)를 사용하여 잔여 여기 라이트를 제거합니다. 형광 emissio에 초점을N 렌즈 볼록 렌즈 (예 : 50.2 F, 뉴 포트 (주))를 사용하여 75 μm의의 핀홀에. 현미경 목표의 공촛점 비행기에 핀홀를 놓습니다. 이 감지기에 형광 신호를 분할하기 위해 다른 이색성 거울 (예 : 630dcxr, 채도 기술 주식 회사)를 사용합니다. 방출 필터 (예 : 채도 기술 공사에서 hq540/80 m 필터)와 이색성 거울에 의해 반사 형광을 필​​터 및 렌즈 볼록 렌즈로 초점 (예 : F = 30.0, ID 25.4 mm, Thorlabs) 첫 번째로 ( '녹색') 검출기. 보조 빨간색 형광단 관련된 실험은 다른 방출 필터 (예 : 채도 기술 공사에서 hq640lp 필터)와 이색성 거울에 의해 전달되는 형광을 필​​터링하고 두 번째 ( '빨간색') 검출기에 다른 렌즈 볼록 렌즈로 초점을하십시오. 형광 광자의 검출을위한 애벌란치 photodiodes (예 : AQR – 141, EG & G, Perkin – 엘머)를 사용합니다. 최종 설정은에서 그림입니다 <str긴 사연이> 그림 2B. 3. 비말 생성 및 데이터 수집 비말 생성 방법 당신은 방울을 생성하는 microchannels의 두 가지 주요 구성을 사용할 수 있습니다. 흐름이 형성 방울 자체 microchannel처럼 넓은대로 두 가지 방법은 한 동일 형식 (그림 3A 및 3B) 6,7을 집중하거나 T – 교차점. 함께 두 혼합할 체액을 가지고하고 인터페이스 개발 이후 모세관 불안정은, monodisperse의 방울이 (몇 femtoliters만큼 작은) 자발적으로 생성되는 이러한 형상을 사용 발생하는 전단 세력의 결과로. 당신은 다른 방법으로 시약을 캡슐 수 있습니다 시약은 준비하고 혼합 칩에서 원하는 혼합물 / 농도, 또는 그들은 이전에 비말 형성 (그림 3C)에 함께 결합 후 칩에 별도로 가져와서 수 있습니다. 이혼합 / 농도가 단순히 상대적인 흐름 속도를 조정하여 변경할 수 있습니다 때문에 마지막 방법은 높은 유연성을 제공합니다. 이것은 세포 캡슐위한 주사기의 세포 현탁액이 실험의 timescale을 통해 세포의 응축을 피하기 위해 만들어 냈다해야한다는 지적이다. 형광 데이터 수집. 데이터 다기능 DAQ 장치에 애벌란치 photodiode 검출기 (2.2.12에서 설명한)에서 커플이 전자 신호 로깅 (예 : PCI 6602, 내쇼날 인 스트 루먼트), 개인 컴퓨터에서 실행. FLIM 실험은 시간 상관 단일 광자 계산에 감지기를 연결을위한 (TCSPC) 카드 (예 : TimeHarp 100, PicoQuant GmbH를) 별도의 PC에서 실행. 각 감지 형광 광자가 입사 레이저 펄스에 상관이며, 따라서 각 방출 형광 광자가 지연 시간을 할당됩니다 :이 카드는 TCSPC 방법론을 사용하여 얻을 수 형광 수명 데이터 수 있습니다. 이 데이터는형광단 / s의 발광 속도 계수 / s의의 평가를 얻기 위해 단일 ​​또는 다중 지수 감쇠 곡선에 장착되어 수 있습니다 검출기의 악기 응답 함수 (IRF)로 원시 데이터를 Deconvolute : 이것은 낮은 농도 Auramine – O 솔루션 (몇 picoseconds의 형광 수명을 전시하는)를 사용하여 얻을 수 있습니다 8. 4. 방울 내에서 혼합의 세포 인식 및 매핑 방울 내에서 혼합의 세포 인식 및 매핑 대장균 맨에게 생존 분석 실험 10 변형을 사용합니다. 문화 하룻밤 Luria – Bertani 국물에 세포 사전 실험 0.5 광학 밀도를 일치합니다. 세포의 생존을 검출 0.4 μm의 SYTO9 1 μm의의 propidium 요오드화물의 사용하십시오. 모두 DNA – intercalating 염료이며, 자신의 형광 강도는 DNA와 결합시 20 폴드에 의해 증가합니다. SYTO9 나에게는 녹색 형광 염료입니다mbrane 투과 및 propidium 요오드화물의 막 스며들지는 빨간색 형광 염료입니다. 죽은 세포가 모두 '녹색'과 '빨간색'배출량을 전시하는 동안 따라서 사는 세포는 '녹색'을 형광. 녹색 / 빨간색 형광 검출을위한 2.2에 도입된 설정)을 사용합니다. 세포 침전을 방지하기 위해 7mm 자기 저어 바가 장착되어 3mL BD plastipak 주사기 내에서 세포 정지를 저어하는 휴대용 미니 자석 활동가를 (유타 바이오 디젤 공급, 유타)를 사용합니다. FLIM를 사용하여 혼합 이벤트 매핑 방울이 흐르는되는 함께 microchannel의 절반 높이의 광학 프로브 볼륨을 중점을두고 있습니다. 이 수성 솔루션 (그림 3C에서와 같이) 다른 특성 형광 수명과 함께 (비 상호 작용) 형광단를 포함하는 각 양식 방울. 채널의 한쪽에서 시작, 1 μm의 간격으로 채널의 전체 너비를 따라 각각의 실험을 수행합니다. 채널 에드레이저 빔을 그들 가까이에 초점을 맞춘되면 형광 강도가 크게 방울로 릿지 쉽게 확인할 수 있습니다. 오일 위상의 소음 배경에서 신호 버스트를 (방울과 관련된) 구분하고 각 버스트의 기간을 설정하는 알고리즘을 구현합니다. 실험이 수행되고있는 특정 너비 각 소적의 길이를 따라 지연 시간과 강도 값을 추출하는 두 번째 알고리즘을 구현 9. 그런 다음 실험에서 각 비말에 대한 형광 수명을 평가하는 최대 가능성 견적 (MLE) 알고리즘을 사용합니다. 8 실험의 모든 방울에 대한 평생 값을 평균 MLE 계산의 마지막 오류 (더 방울이 탐지를 감소 오류가 작은). 평생 궤도 각 너비 획득되면, 2D지도에있는 모든 탄도를 결합. 각각의 평생 가치는 particu와 관련된 있기 때문에고맙다 두 fluorophores의 혼합물은 농도 (또는 혼합)지도함으로써 얻을 수 있습니다. 선택, 소적 믹싱의 3D지도는 쉽게 microfluidic 채널의 높이를 따라 다른 위치에서이 프로토콜을 반복하여 얻을 수 있습니다. 5. 데이터 분석 원시 실험 데이터 파일에 적절한 컴퓨팅 언어로를 Reinterpret 그래서 그들은 더 이상 분석할 수 있습니다 (시간이지나면서 광자 카운트의 변화를 포함 예를 들어 텍스트 파일, 쉽게 데이터 처리 및 분석을위한 Matlab으로 추출 수 있습니다.) 당신은 MLE 알고리즘을 실행하거나 평생 궤도에서 혼합 패턴의 2D지도를 구축하기 위해 더 복잡한 실험 파일 (예 : FLIM에 대한 것과 같은) 또는 순서에 포함된 데이터에 액세스하기 위해 특정 코드를 작성해야 할 수도 있습니다. 6. 대표 결과 세포 인식 var에의 전형적인 예입니다세포 기반의 실험 시간의 함수로 계산 광자의 iation는 이백 밀리초의 기간 동안, 그림 4A 및 C에 표시됩니다. 중요한 Luria – Bertani 국물 (LB 매체) 수성 비말 경계를 정의 약하게 fluorescing 배경 역할, 개별 세포의 존재에 해당하는 별개의 광자 파열을 반면이 배경 위에 구분할 수 있습니다. LB 형광 배경이 약 직사각형 단면 (빨간색과 초록색 점선으로 표시)이 특징입니다. 형광 파열의 전체 폭 절반 최대 (FWHM)은 E. 인한 대장균 세포는 상대적 방울의 길이 (30 picolitres의 볼륨에 해당하는 40 미크론)과 E.과 일치 배경 비말 행사보다 30 배 단축됩니다 대장균 세포 (1.5-2.0 미크론) 10. 듀얼 채널 검색을 통해이온 시스템, 라이브 세포 또는 죽은 세포의 존재는 녹색과 빨간색 채널의 분석에서 구별하실 수 있습니다. 그림 4 B와 D는 소적 당 세포의 숫자를 설명하는 확률 분포를 보여줍니다. FLIM를 사용하여 혼합 이벤트 매핑 분자 형광 수명은 자사의 화학적 환경에 영향을받습니다 개별 형광단의 본질적 속성입니다. 따라서 그 성능은 같은 농도, 여기 강도, 광학 모음으로 실험적인 요소 (에 의존 시간을 통합 형광 측정,보다 우수한 해상도와 정밀도와 환경 정보 (예 : 솔루션 산도, 온도, 극성과 점도 등)을 구하는 데 사용할 수 있습니다 효율성). 9,11 마찬가지로 다른 제공, 8 디 두 fluorophores을 사용하여 방울 내부의 혼합 패턴을지도하는 것이 가능fferent 평생 값. 등식 1에 표시된대로 두 (비 상호 작용) 형광 종을 포함하는 혼합물에서 부패가 biexponential 양식에 걸릴 것입니다 : 각각의 수명은 τ1 및 τ2로 정의하며, 각 구성 요소의 진폭은 각각 α1과 α2에 의해 주어진다. 평균 수명은 다음 다음과 같이 정의할 수 있습니다 : β1과 β2는 각 구성 요소의 분율이며 다음과 같이 정의됩니다 장소 : 프로브 볼륨이 고정되어 있으며 방울이 그 자리에 걸쳐 흐르는 때문에, 일생 일대의 궤도가 특정 너비의 방울의 길이를 따라 값을 따라서 얻을 수 있습니다. averag 특정 넓이에 대한 특성 궤도,6000 방울 중 에드는 그림 5A에서 볼 수 있습니다. 채널의 전체 너비에 걸쳐 궤도를 결합하는 것은 2D 농도 (또는 혼합)지도의 형성에 이르게한다. 전형 결과는 그림 5B에 표시됩니다. 방울 많은 가운데 그 결과를 평균하여 얻은 결과의 표준 오류는 크게 (그림 5A에 대한 95 % 신뢰 구간과 표준 오차 1 %) 줄일 수있다. 평생 궤도의 결정 방법은 모든 방울들이 실질적으로 동일하다고 가정합니다. 방울이 크게 달랐다면, 얻은 평균 수명의 탄도는 (그리고 평균 방울의 길이를 따라 평생 날카로​​운 차이를 지속적으로 감지), 덜 diverging 프로필을 아첨 것이다 : 이것은 두 가지 이유로 대부분 올바른 것으로 입증됩니다. 또한, 결과에 관계없이 개인의 재현성 아르방울은 분석이나 방울의 크기가 계산에 사용 8. microfluidic 칩 제조의 그림 1. 프로세스 흐름. 그림 2 비말 형성을위한 microfluidic 칩에 연결된 주사기 펌프와 주사기, 대표) 다이어그램, 두 레이저에 대한 전형적인 광학 설치의 B) 도식 표현 – 두 형광단 (녹색과 적색) 여기와 감지.. DC = 이색성 거울, EM = 방출 필터, L = 렌즈, PH = 핀 홀, APD = 애벌란치 photodiode 검출기. 그림 3 온칩 비말 형성 전략 :) 흐름 초점을 구성, B) T – 접합 구성.. C) 박사의 칩 캡슐에이 원래 별도의 수성 시약의 oplets. 그림 4 광학 (가) 죽은 기록된 0.2의 흔적을 판독하고 (C) 라이브 셀 (세포 현탁액에 대한 유동 속도 : 1 μl 분 -1, 기름 : 2 μl 분 -1).. 각 아치 모양의 신호는 점선 라인으로 표시 비말 경계와 수성 비말을 형성 약하게 형광 LB 매체에 해당합니다. 녹색 신호는 633 나노미터 파장 633nm 이상의 붉은 신호에 따라 기록을 나타냅니다. 세포는 DNA intercalating 염료로 인해 발생하는 수직 스파이크로 구분할 수 있습니다. (B) 죽은 세포 및 (D) 라이브 셀 하나의 방울 내에서 세포 인에 대한 확률 분포. 그림 5 특정 너비의 비말의 길이를 따라) 전형적인 평균 수명 궤도;. B)모든 평균 궤도의 결합의 전형적인 표현 (%의 FITC / % STR – AF488으로 표현 또는 농도) 2D 평생지도에 방울의 전체 너비를 따라 탐지.