店经营CA的程度<sup> 2</sup使用荧光钙可以监视>进入(SOCE)<sup> 2</sup>指标。锰<sup> 2</sup>等指标检测在培养细胞和骨骼肌纤维的SOCE淬火。允许的时间和空间分辨率SOCE机械剥皮的肌肉纤维的共焦成像的一种技术也被描述。
商店经营的Ca 2 +进入(SOCE),早期称为库容的Ca 2 +进入,是一个涌入细胞外Ca 2 +进入细胞,以补充枯竭的内质网(ER)或肌浆网(SR)的Ca 2 +商店严格监管机制1,2。由于钙离子是一种普遍存在的第二信使,它是不奇怪,SOCE多种细胞过程中起着重要的作用,包括增殖,凋亡,基因转录和运动。由于其广泛发生在几乎所有类型的细胞,包括上皮细胞和骨骼肌,这一途径已得到极大的兴趣3,4。然而,在不同类型的细胞和生理功能的SOCE特征的异质性仍然不明确5-7。
SOCE功能的通道特性可以发现,而大量的知识约氏体膜片钳研究基于荧光的细胞内钙离子的测量,因为它的方便和高通量筛选的可行性已经获得人生道路。本报告的目的是总结了一些基于荧光的方法来衡量SOCE在单层细胞,悬浮细胞和肌纤维5,8-10激活。最常使用这些荧光的方法是直接动态监测胞内Ca 2 +使用的F 340nm的发射波长(510 nm)的比例的Ca 2 +荧光浓度指示剂fura-2和F 380nm的比例。隔离开来单向SOCE活性细胞内Ca 2 +释放和Ca 2 +挤压,常用的Mn 2 +淬火法。锰2 +被称为是能够渗透到细胞通过SOCE,而这是防渗膜表面的挤压过程,或雌激素受体 摄取钙+泵由于其非常高的亲和力机智ĤFURA-2。因此,外锰2 +进入细胞诱导的Fura-2荧光猝灭SOCE 9测量的活动。可以进行比率测量和Mn +2淬火检测细胞的人口模式,或在显微镜为基础的系统,以可视化的单细胞在试管基于分光光度计。单细胞测量的优点是可以选择使用GFP或RFP的记者,让转基因或突变的细胞研究,基因操作的单个细胞。 SOCE结构专门骨骼肌中的时空特征,可以实现皮肤的肌纤维,同时监测两个低亲和力钙荧光FLUO-5N,如肌纤维中的SR和具体的车厢有针对性地+指标Rhod 5N在横管9,11,12。
虽然的Ca 2 +结合的Ca 2 +免费的Fura-2激发波长为340 nm和380 nm处,分别的最佳比例的Fura-2的动态范围为Ca 2 +浓度测量,可能会发生在其他波长在一个特定的显微镜系统。波长的这种变化通常是由于除了与各种光学元件的光学路径的变化。在这项研究中,FURA-2激发波长为350 nm和390 nm的决定FURA-2荧光光谱的分析。
细胞内Ca 2 +水平的细胞质结果从几个来源的平衡,包括细胞内Ca 2 +释放,细胞外Ca 2 +进入,以及在ER和细胞膜钙离子排斥机制。为了隔离从单向SOC介导的Ca 2 +涌入细胞内Ca 2 +释放和Ca + EXTR延髓的Mn 2 +淬火法都可以使用。锰2 +被称为是能够渗透到细胞通过SOCE,但防渗膜表面挤压或吸收钙的ER +泵。因此,荧光猝灭代表进入细胞的单向锰2 +流量测量估计SOCE激活程度。锰2 +淬火法等色点波长在这样的Fura-2荧光强度是独立的Ca 2 +浓度。为每个系统等色点应确定由光谱扫描。另外, 锰+淬火可以在任何两个波长,在这样一种方式,最终的价值是独立的Ca 2 +浓度13记录调整后的荧光。
为了获得的SOCE骨骼肌肉的活动空间和时间的信息,我们采用双染的方法,它允许同时measuremeNT SOCE活性和SR的Ca 2 +在皮肤成年哺乳动物的EDL肌纤维含量。 SR钙2的变化之间的关系+活动内容和SOCE可以绘制指示阈值和灵敏度SOCE激活枯竭的SR的Ca 2 +存储的。 TT加载的解决方案进行了优化,另外加载的T管与Ca 2 +和吸T型管和SR的装载解决方案旨在促进最大的SR的Ca 2 +负荷,另外加载的T-管〜500微米的Ca 2 +。 FCCP在TT /简加载的解决方案和SR消耗的解决方案,以消除从线粒体的影响。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢这个手稿的阅读和编辑医生诺亚魏斯勒德。这项工作得到了香港研究资助UMDNJ基金会62-09透明带,美国心脏协会SDG2630086到新征,0535555N到MB,国立卫生研究院RC2AR058962-01到MB。
Table of specific reagents and equipment:
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
RPMI 1640 | Mediatech | 10-040-CV | |
Ham’s F-12 | Mediatech | 10-080-CV | |
DMEM | Mediatech | 10-013-CV | |
Glass Bottom Dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
Fura-2 AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | -20°C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO |
Fluo-5N AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F14204 | -20°C, seal tight, protected from light |
Rhod-5N | Invitrogen (Molecular Probes) | R14207 | -20°C, seal tight, protected from light |
Quartz Cuvette | Starna Cells | 3-Q-10 | |
thapsigargin | Tocris | 1138 | |
2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) | Tocris | 1224 | |
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) | Sigma-Aldrich | 435600 | |
Collagenase Type I | Sigma | C0130 |
Equipment: