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免疫学と感染

Mit Reverse-Genetics der NSS Gene des Rift Valley Fever Virus MP-12-Stamm zu Vaccine Safety und Wirksamkeit zu verbessern Manipulieren

Published: November 01, 2011
doi:
10.3791/3400
, , ,
1病理学科,University of Texas Medical Branch

概要

Die reverse Genetik für die Rift Valley-Fieber-Virus MP-12 Impfstamm ist ein nützliches Werkzeug für die Schaffung zusätzlicher MP-12-Mutanten mit erhöhter Dämpfung und Immunogenität. Wir beschreiben das Protokoll zu erzeugen und zu charakterisieren NSs Mutanten.

Abstract

Rift Valley-Fieber-Virus (RVFV), die hämorrhagisches Fieber, neurologischen Erkrankungen oder Erblindung bei Menschen, und eine hohe Rate Abtreibung und fetale Missbildungen bei Wiederkäuern 1 bewirkt hat als HHS / USDA eingestuft überschneiden wählen Agent und eine Risikogruppe 3 Erreger. Es gehört zur Gattung Phlebovirus in der Familie Bunyaviridae und ist einer der bösartigsten Mitglieder dieser Familie. Mehrere reversen Genetik-Systeme für den RVFV MP-12 Impfstamm 2,3 sowie Wildtyp-RVFV Stämme 4-6, einschließlich ZH548 und ZH501, seit 2006 entwickelt worden. Der MP-12-Stamm (das ist ein Risiko, Gruppe 2 Erreger und einem Nicht-wählen-Agent) ist stark gedämpft durch mehrere Mutationen im M-und L-Segmente, aber trägt noch virulent S-Segment RNA 3, die eine funktionelle Virulenz kodiert Faktor, NSS. Die rMP12-C13type (C13type) tragen 69% in-frame-Deletion von NSS ORF fehlt allen bekannten NSs Funktionen, während es als effic repliziertient ebenso wie MP-12 in VeroE6 Zellen ohne Typ-I-IFN. NSs induziert eine Abschaltung von Host-Transkription einschließlich Interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 und fördert Abbau von doppelsträngigen RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) in der post-translationalen Ebene. 9,10 IFN-beta ist transkriptionell hochreguliert durch Interferon regulatory factor 3 (IRF-3), NF-kB und Aktivator-Protein-1 (AP-1), und die Bindung von IFN-beta zu IFN-alpha/beta Rezeptor (IFNAR) stimuliert die Transkription von IFN-alpha Gene oder anderen Interferon-stimulierten Genen (ISGs) 11, welcher Host antivirale Aktivitäten induziert, während Host Transkription Unterdrückung einschließlich IFN-beta-Gen von NSS verhindert das Gen upregulations dieser ISGs in Reaktion auf die virale Replikation, obwohl IRF-3, NF-kB und Aktivator Protein-1 (AP-1) kann durch RVFV7 aktiviert werden. . So ist NSs ein hervorragendes Ziel weiter dämpfen MP-12 und zum Host angeborenen Immunantwort durch die Abschaffung der IFN-beta Unterdrückung Funktion zu verbessern. HierWir beschreiben ein Protokoll zur Erzeugung eines rekombinanten MP-12-Codierung mutierte NSS und liefern ein Beispiel für ein Screening-Verfahren auf NSS-Mutanten fehlt die Funktion, IFN-beta-mRNA-Synthese zu unterdrücken identifizieren. Zusätzlich zu ihrer wesentlichen Rolle in der angeborenen Immunität, ist der Typ-I IFN für die Reifung von dendritischen Zellen und die Induktion einer adaptiven Immunantwort 12-14 wichtig. So induzieren NSs Mutanten-Typ-I IFN sind weiter abgeschwächt, aber gleichzeitig sind effizienter zu stimulieren Host Immunreaktionen als Wildtyp-MP-12, die sie zu idealen Kandidaten für die Impfung Ansätze macht.

Protocol

1. Rückgewinnung von rekombinanten MP-12-Codierung NSs Mutation (en) von Plasmid-DNA 2 Spread-Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK) / T7-9-Zellen 15, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase, in 6-cm-Schalen in Minimum Essential Medium (MEM)-alpha (Invitrogen, Kat. Nr. 32561037) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS ), Penicillin-Streptomycin (Penicillin: 100 U / ml, Streptomycin: 100 pg / ml) (Invitrogen, Kat. Nr. 15140122) und 600 pg / ml Hygromycin B (CellGro, Kat. Nr. 30 bis 240-CR). …

Discussion

Die reverse Genetik für RVFV wurden von mehreren Gruppen wurden durch den Einsatz T7-Promotor 2,4,5 oder Maus 3 oder menschliche 4 pol-I-Promotor entwickelt. In diesem Manuskript, beschreiben wir ein Protokoll zur rekombinanten RVFV MP-12-Stämme mit BHK/T7-9 Zellen 15, die stabil exprimieren, T7-RNA-Polymerase zu erzeugen. Die Effizienz der viralen Erholung variiert je nach Zustand des BHK/T7-9 Zellen, die Menge von Plasmiden, die Anzahl der transfizierten Zellen und so weit…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Grant Number 5 U54 AI057156-07 durch Western Regional Center of Excellence (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 von National Institute of Allergy and Infectious Diseases, und eine interne Finanzierung von Sealy Center for Vaccine Development an der Universität finanziert Texas Medical Branch.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha Invitrogen 32561037  
Dulbecco’s modified minimum essential medium Invitrogen 11965092  
Modified Eagle Medium (MEM 2x) Invitrogen 11935046  
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122  
Hygromycin B Cellgro 30-240-CR  
Tryptose phosphate broth MP biomedicals 1682149  
Noble agar VWR 101170-362  
TransIT-LT1 Mirus MIR2300  
Opti-MEM Invitrogen 31985070  
Aerosol tight lid Eppendorf C-2223-25  
0.33% neutral red solution Sigma Aldrich N2889-100ML  
C57/WT MEF cells InvivoGen mef-c57wt  
Blasticidin S InvivoGen Ant-bl-1  
Zeocin InvivoGen ant-zn-1  
QUANTI-Blue InvivoGen rep-qb1  
BHK/T7-9 cells15 Gifu university, Japan    
Vero E6 cells ATCC CRL-1586  
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参考文献

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Reverse GeneticsNSs GeneRift Valley Fever VirusMP-12 StrainVaccine SafetyVaccine EfficacyHemorrhagic FeverNeurological DisordersBlindnessAbortionFetal MalformationHHS/USDA Overlap Select AgentRisk Group 3 PathogenPhlebovirusBunyaviridae FamilyVirulentRVFV MP-12 Vaccine StrainWild-type RVFV StrainsZH548ZH501M-segmentL-segmentS-segment RNA3Functional Virulence Factor NSsRMP12-C13typeIn-frame Deletion Of NSs ORFHost Transcription Shut-offInterferon (IFN)-beta MRNA78Double-stranded RNA-dependent Protein Kinase (PKR)Post-translational Level Degradation Of PKR

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Kalveram, B., Lihoradova, O., Indran, S. V., Ikegami, T. Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy. J. Vis. Exp. (57), e3400, doi:10.3791/3400 (2011).
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