En utilisant la génétique inverse pour manipuler les gènes NSS du virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche pour améliorer la sécurité vaccinale et l'efficacité
概要
Le système de génétique inverse pour le virus de la fièvre vallée du Rift MP-12 souche vaccinale est un outil utile pour créer des supplémentaires MP-12 mutants avec une atténuation accrue et l'immunogénicité. Nous décrivons le protocole de générer et caractériser NSs souches mutantes.
Abstract
Virus de la fièvre vallée du Rift (FVR), qui provoque une fièvre hémorragique, des troubles neurologiques ou de cécité chez les humains, et un taux élevé d'avortement et de malformations fœtales chez les ruminants 1, a été classé comme un HHS / USDA chevauchent agent de sélection et un groupe de risque 3 pathogène. Il appartient au genre Phlebovirus de la famille des Bunyaviridae et est l'un des membres les plus virulents de cette famille. Plusieurs systèmes de génétique inverse pour la souche RVFV MP-12 2,3 vaccins ainsi que des souches de type sauvage RVFV 4-6, y compris les ZH548 ZH501 et ont été développés depuis 2006. Le MP-12 souche (qui est un groupe de risque 2 et un agent pathogène non-sélection) est fortement atténué par plusieurs mutations dans son M-et L-segments, mais porte toujours virulentes S-segment d'ARN 3, qui code une virulence fonctionnelle facteur, NSS. Le rMP12-C13type (C13type) transportant 69% dans le châssis-suppression de NSS ORF manque toutes les fonctions connues NSs, tandis qu'il réplique que efficient tout comme MP-12 dans des cellules dépourvues VeroE6 type I IFN. NSs induit un arrêt de la transcription de l'hôte dont l'interféron (IFN)-bêta ARNm 7,8 et favorise la dégradation de la double-brin protéine kinase dépendante de l'ARN (PKR) au niveau post-traductionnelles. 9,10 IFN-bêta est transcriptionnellement régulés par interferon regulatory factor 3 (IRF-3), NF-kB et la protéine activatrice-1 (AP-1), et la liaison de l'IFN-bêta à IFN-alpha/beta récepteur (IFNAR) stimule la transcription de l'IFN-alpha gènes ou d'autres gènes d'interféron stimulée (ISGS) 11, ce qui induit des activités d'accueil antiviraux, alors que la suppression de la transcription d'hôte incluant l'IFN-bêta du gène par le NSS empêche le gène de ceux upregulations ISGS en réponse à la réplication virale, bien que l'IRF-3, NF-kB et l'activateur protein-1 (AP-1) peut être activé par RVFV7. . Ainsi, NSS est une excellente cible pour atténuer encore MP-12, et d'améliorer la réponse immunitaire innée de l'hôte en abolissant la fonction de suppression de l'IFN-bêta. Voici, Nous décrivons un protocole pour générer un SSN-12 recombinante MP encodage muté, et fournir un exemple d'une méthode de dépistage pour identifier les mutants NSs manque la fonction pour supprimer synthèse de l'ARNm de l'IFN-bêta. En plus de son rôle essentiel dans l'immunité innée, l'IFN de type I est important pour la maturation des cellules dendritiques et l'induction d'une réponse immunitaire adaptative 12-14. Ainsi, les mutants NSs induisant l'IFN de type I sont plus atténuées, mais en même temps, sont plus efficaces pour stimuler des réponses immunitaires que l'hôte de type sauvage MP-12, qui fait des candidats idéaux pour des approches de vaccination.
Protocol
Discussion
Systèmes de génétique inverse pour les RVFV ont été développés par plusieurs groupes en utilisant le promoteur T7 2,4,5 ou une souris 3 ou 4 humains Pol-i promoteur. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole visant à générer des recombinants RVFV MP-12 souches en utilisant BHK/T7-9 cellules 15 qui expriment de façon stable la T7 RNA polymérase. L'efficacité de la récupération virale varie en fonction de l'état de BHK/T7-9 cellules, le montant des …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la concession numéro 5 U54 AI057156-07 par le centre régional de l'Ouest d'excellence (WRCE), 1 R01-A1 AI08764301 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, et d'un financement interne du Centre de développement des vaccins Sealy à l'Université de Texas Medical Branch.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
参考文献
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
