Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren
概要
De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.
Abstract
Rift Valley-koorts virus (RVFV), dat hemorragische koorts, neurologische aandoeningen of blindheid bij mensen, en een hoog percentage abortussen en foetale misvormingen bij herkauwers 1 veroorzaakt, is geclassificeerd als een HHS / USDA overlap te selecteren agent en een risico groep 3 ziekteverwekker. Het behoort tot het geslacht Phlebovirus in de familie Bunyaviridae en is een van de meest virulente leden van deze familie. Verschillende reverse genetics systemen voor de RVFV MP-12 vaccinstam 2,3 evenals wild-type stammen RVFV 4-6, waaronder ZH548 en ZH501, zijn ontwikkeld sinds 2006. De MP-12 stam (dat is een risico groep 2 ziekteverwekker en een niet-select agent) is sterk verzwakt door verschillende mutaties in de M-en L-segmenten, maar nog steeds draagt virulente S-segment RNA 3, die een functionele virulentie codeert factor, NSS. De RMP12-C13type (C13type) dragen 69% in-frame verwijderen van NSS ORF mist alle bekende NSS-functies, terwijl het repliceert als efficient doet als MP-12 in VeroE6 cellen ontbreekt type I IFN. NSS induceert een shut-off van gastheer transcriptie waaronder interferon (IFN)-bèta mRNA 7,8 en bevordert de afbraak van double-stranded RNA-afhankelijke proteïne kinase (PKR) op de post-translationele niveau. 9,10 IFN-beta is transcriptioneel opgereguleerd door interferon regulerende factor 3 (IRF-3), NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1), en de binding van IFN-beta aan IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimuleert de transcriptie van IFN-alfa genen of andere interferon gestimuleerde genen (ISGs) 11, welke host antivirale activiteiten induceert, terwijl gastheer transcriptie onderdrukking waaronder IFN-beta-gen door NSS voorkomt dat het gen upregulations van die ISGs in reactie op virale replicatie, hoewel IRF-3, NF-kB en activator proteïne-1 (AP-1) kan geactiveerd worden door RVFV7. . Zo NSS is een uitstekend doelwit verder te verzwakken MP-12 en voor het hosten aangeboren immuunrespons te verhogen door het afschaffen van de IFN-beta onderdrukking functie. HierBeschrijven we een protocol voor het genereren van een recombinant MP-12 codering gemuteerde NSS, en geven een voorbeeld van een screening methode om NSS mutanten die niet over de functie om IFN-beta mRNA-synthese onderdrukken identificeren. In aanvulling op haar essentiële rol in de aangeboren immuniteit, type-I IFN is belangrijk voor de rijping van dendritische cellen en de inductie van een adaptieve immuunrespons 12-14. Zo NSS mutanten het induceren van type I IFN worden verder verzwakt, maar tegelijkertijd efficiënter zijn op het stimuleren gastheer immuunreacties dan wild-type MP-12, waardoor ze ideale kandidaten voor vaccinatie benaderingen.
Protocol
Discussion
Reverse genetics voor RVFV zijn ontwikkeld door verschillende groepen door gebruik te maken van T7-promotor 2,4,5 of muis 3 of 4 mensen pol-I promotor. In dit manuscript beschrijven we een protocol om recombinant RVFV MP-12-stammen te genereren door gebruik te maken BHK/T7-9 cellen 15 die stabiel uitdrukken T7 RNA-polymerase. De efficiëntie van virale herstel gevarieerd afhankelijk van de conditie van BHK/T7-9 cellen, de hoogte van plasmiden, het aantal getransfecteerde celle…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door Grant Nummer 5 U54 AI057156-07 door de Western Regional Center of Excellence (WRCE), een R01 AI08764301-A1 van Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, en een interne financiering van Sealy Center for Vaccine Development aan de Universiteit van Texas Medical Branch.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
参考文献
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
