باستخدام علم الوراثة العكسية للتلاعب الجيني NSS لفيروس حمى الوادي المتصدع MP - 12 سلالة لتحسين سلامة وفعالية اللقاحات
概要
نظام الوراثة العكسية للMP – 12 لحمى الوادي المتصدع فيروس سلالة اللقاح هي أداة مفيدة لخلق إضافية MP – 12 المسوخ مع تخفيف وزيادة المناعة. نحن تصف البروتوكول لتوليد سلالات متحولة وتوصيف NSS.
Abstract
تم تصنيف فيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV) ، والذي يسبب الحمى النزفية ، واضطرابات عصبية أو العمى في البشر ، وارتفاع معدل الإجهاض وتشوه الأجنة في المجترات 1 ، باعتباره HHS / وكيل وزارة الزراعة الأميركية التداخل تحديد المخاطر والعوامل المسببة للأمراض المجموعة 3. انه ينتمي الى جنس الفاصدة Phlebovirus في الأسرة والفيروسات البنياوية هي واحدة من أكثر أفراد هذه العائلة الخبيثة. وقد تم تطوير عدة أنظمة الوراثة العكسية للسلالة MP – 12 RVFV قاح 2،3 فضلا عن السلالات البرية من نوع RVFV 4-6 ، بما في ذلك ZH548 وZH501 ، منذ عام 2006. و- 12 MP سلالة (الذي يشكل خطرا المجموعة 2 الممرض وعامل عدم تحديد) وموهن للغاية من قبل العديد من الطفرات في تقريرها M – L – والشرائح ، ولكن لا يزال يحمل خبثا S – RNA الجزء 3 ، الذي يشفر الفوعة وظيفية عامل ، NSS. وrMP12 – C13type (C13type) تحمل 69 ٪ في الإطار حذف ORF NSS تفتقر جميع وظائف NSS المعروفة ، في حين أنه يكرر ما efficient كما يفعل MP – 12 في الخلايا التي تفتقر VeroE6 النوع الأول الإنترفيرون. NSS يحرض للإيقاف من النسخ المضيفة بما في ذلك الإنترفيرون (الإنترفيرون) بيتا 7،8 مرنا ويعزز تدهور المزدوج تقطعت بهم السبل بروتين كيناز التي تعتمد على الحمض النووي الريبي (PKR) في مرحلة ما بعد متعدية. 9،10 الإنترفيرون بيتا transcriptionally upregulated بواسطة عامل إنترفيرون التنظيمية 3 (IRF – 3) ، NF كيلوبايت والبروتين المنشط – 1 (AP – 1) ، والملزمة لالإنترفيرون بيتا لمستقبلات IFN-alpha/beta (IFNAR) يحفز النسخ من الإنترفيرون ألفا الجينات أو غيرها من الجينات الإنترفيرون حفز (ISGs) 11 ، والذي يدفع الأنشطة المضيفة للفيروسات ، في حين تستضيف قمع النسخ بما في ذلك الإنترفيرون بيتا الجينات التي كتبها NSS يمنع upregulations تلك الجينات ISGs ردا على الرغم من تكاثر الفيروس IRF – 3 ، NF – KB ومنشط البروتين – 1 يمكن تفعيلها (AP – 1) بواسطة RVFV7. . وهكذا ، NSS هو هدف ممتازة لتخفيف مزيد من MP – 12 ، وتعزيز الاستجابات المناعية الفطرية المضيفة من خلال إلغاء وظيفة قمع الإنترفيرون بيتا. هنا، ونحن تصف بروتوكول للتوليد المؤتلف النائب NSS – 12 ترميز تحور ، ومثالا لطريقة الفرز لتحديد المسوخ NSS تفتقر إلى وظيفة لقمع الإنترفيرون بيتا التوليف مرنا. بالإضافة إلى دورها الأساسي في المناعة الفطرية ، النوع الأول هو الإنترفيرون مهمة لنضوج الخلايا الجذعية وتحريض استجابة مناعية التكيف 12-14. وبالتالي ، إحداث نوع المسوخ NSS – I الإنترفيرون وكذلك الموهن ، ولكن في نفس الوقت أكثر كفاءة في تحفيز استجابات المضيف المناعية من النوع البري من MP – 12 ، مما يجعلها مثالية للمرشحين نهج التطعيم.
Protocol
Discussion
وقد وضعت نظم لعلم الوراثة العكسية RVFV عدة جماعات من خلال الاستفادة من T7 المروج 2،4،5 أو الماوس 3 أو 4 المروج بول الإنسان الأول. في هذا المخطوط ، وصفنا بروتوكول لتوليد المؤتلف MP – 12 RVFV سلالات باستخدام الخلايا ال 15 التي BHK/T7-9 ستابلي أعرب بوليميريز RNA T7….
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من حيث عدد المنح 5 AI057156 U54 – 07 من خلال المركز الإقليمي للتميز الغربية (WRCE) ، 1 AI08764301 R01 – A1 من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية ، والتمويل الداخلي من مركز سيلي استحداث اللقاحات في جامعة تكساس الطبية فرع.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
参考文献
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e. Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
