Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

Deel 1A. Uitrusting Microscoop: rechtop stereo-ontleden bereik met laag vermogen doel Spanning / Pulse Generator: BTX ECM 830 blokgolf Elektroporatie System Pipet trekker: P-87 Micropipet Puller (Sutter Instrument Company, CA) Manipulator: grof, of gecombineerde grof en fijn afhankelijk van de voorbereiding. Micropipet houder: Fine Science Tools Elektrode: zelfgemaakte Elektroporatie kamer: zelfgemaakte L-vormige elektroden: Snij 8 cm van hoge zuiverheid 0,4 mm wolfraam draad (Goodfellow) en brengen op middelpunt een 1 ml spuit met behulp van putty (we gebruiken Blu-Tack). Laat 4 cm wolfraam draad bloot van het uiteinde van de spuit en buig tip in L-vorm, 1 cm van het einde (Fig. 1A). Trim tip zodat het uiteinde 0,5 mm maatregelen in de lengte. TZijn tip is de elektrode eindpunt. Run overtollige wolfraam draad parallel aan de spuit en gebruik deze om de elektrode puls generator aan te sluiten. Herhaal het proces maken van een paar elektroden. Bevestig de elektroden op blokgolf generator via DC-kabels. Elektroporatie kamer Lijn bodem van 90 mm schotel met ~ 5 mm niet-giftig plasticine. Vul de schotel met elektroporatie media. Met behulp van nr. 5 horlogemakerij pincet carve een T-vormige goed (afb. 2). De lange goed zou moeten meten ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm en de korte ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. De elektroporatie schotel kan worden gewassen en hergebruikt. Deel 1B. Reagentia DNA of geladen macromoleculen Micropipetten: 1 mm breed 4 "lang borosilicaatglas capillairen (WPI, TW100-F) Cultuur media: Normaal Amfibie Media (NAM) > 10 X voorraad: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. Autoclaaf en bewaren bij 4 ° C. 1 X NAM: verdunnen van 10x voorraad, buffer met 0,1 mM NaHCO 3 en 0,2 mM Na 3 PO 4. Xenopus laevis kikkervisjes, stage 28 DNA voorbereiding: Bereid expressieplasmiden met behulp van standaard protocollen. Resuspendeer DNA tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ul in nuclease gratis H 2 0. * We hebben succes gehad met vectoren die een sterke CMV promoter, zoals pCS2 + [16]. Voor de afstamming analyse, we zijn doorgaans voorzien van DNA dat codeert voor groen fluorescent eiwit (GFP pCS2 +) bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 pg / pl. [DNA-concentraties tussen 0,1-3 ng / ul werden ook getest. We vonden dat de concentraties lager dan 0.8 ng / ul inefficiënt gelabelde cellen, terwijl de DNA-concentraties van meer dan 2 g / & mU; Ik wist niet beter elektroporatie efficiency]. Morfolino oligonucleotide voorbereiding: (Let op:. MO's dienen te worden fluoresceinated (3'-carboxyfluoresceïne gewijzigd) of anders betalen) Resuspendeer morfolino oligonucleotiden (MO) (Genetools, www.genetools.com ) bij een concentratie van 2 mM in nuclease gratis H 2 0. Warmte hoeveelheid op voorraad oplossing bij 65 ° C gedurende 5 minuten. Verdun tot uiteindelijke concentratie van 0,5 mM in nuclease vrij water. * 0,1-1mm MO oplossingen werden getest. 0,5 mM MO oplossingen voldoende waren voor elektroporatie van vele mesenchymale cellen. Micropipetten Bereid micropipetten van borosilicaatglas capillairen (1 mm breed, 4 "lang, WPI nee. TW100-F). Gebruik naald trekker te micropipetten te bereiden met een 8-12 mm lange taps en fijne tip. Crush tip ~ 2 mmvan de spuitkop en pincet, het creëren van een gekarteld breken. Media Incubatie media: Bereid 3 / 4 Normale Amfibie Media (NAM) van 1x voorraad. Voeg 0,025 mg / ml gentamycine. Elektroporatie media: als hierboven, met 0,1% benzocaïne (Sigma, 06950). 2. Elektroporatie Micropipet setup Vul micropipet met ~ 1 ui oplossing voor injectie. Secure micropipet in micromanipulator en hechten aan microinjector (Picospritzer II). Hoek micropipet op 50 ° ten opzichte van het tafelblad. Stel inspuitdruk bij 20 PSI. Kalibreren micropipet tot 30 nl per puls injecteren. Tadpole voorbereiding Verdoven stadium 28 Xenopus larven door het incuberen in elektroporatie media voor 5 minuten. Overdracht onder narcose kikkervisje in elektroporatie kamer gevuld met elektroporatie media. Positie embryobinnen de lange goed, zodat de hoofdsteunen in de T-splitsing met de dorsale zijde naar beneden en worden blootgesteld buikzijde. Het hoofd enigszins dient te worden verhoogd ten opzichte van de staart. Met behulp van een tang voorzichtig veilig kikkervisje goed aan bij omliggende plasticine. (Let op:.. Als het kikkervisje is niet beveiligd, kan trillen en elektrode tijdens elektroporatie contact In dit geval is het kikkervisje als gezichtstissues zal ernstig worden beschadigd weggooien) Elektroporatie Plaats micropipet tip direct plaatsvond na de cement klier en in het gezicht mesenchym. Injecteer 30 nl oplossing in mesenchym. Schuif micropipet. Snel uitlijnen elektrode tips parallel aan het hoofd van het embryo (afb. 3). Breng 8 50 ms, 20mV vierkante pulsen. Schuif elektroden. Met behulp van een tang voorzichtig kikkervisje vrijlating uit de put en transfer naar 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml gentamycine. Kikkervisjes kunnen worden geïncubeerd in 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnight, of langer. Scherm embryo's voor een efficiënte elektroporatie door fluorescentie microscopie na 24 uur. 3. Representatieve resultaten: Het gebruik van fluorescerende moleculen maakt eenvoudige screening van embryo's geëlektroporeerd. Figuur 4 toont een typische partij van MO geëlektroporeerd kikkervisjes ~ 12, 48 en 96 uur na elektroporatie, geïncubeerd bij 14,5 ° C. Met behulp van fluorescentie microscopie, kan MO's zichtbaar worden gemaakt direct na de elektroporatie en aanhouden enkele dagen na elektroporatie. In onze ervaring, fluorescentie is zwak evident in stadium 46 (~ 5 dagen later). In het kraakbeen, fluorescentie daalt dramatisch na het begin van differentiatie (~ 42 st), maar MO fluorescentie blijft sterker in andere celtypen, zoals de faryngeale endoderm. Fluorescentie microscopie laat zien dat oligonucleotiden zijn opgenomen in diverse weefsels waaronder craniofaciale kraakbeen. Oligonucleotide fluorescentie ceen vaak gevisualiseerd worden in het weefsel aan weerszijden van het hoofd. Dit is waarschijnlijk te wijten aan een snelle verspreiding van de injectie-oplossing in de losse craniofaciale mesenchym voorafgaand aan de elektroporatie. Figuur 1 Homemade elektroden. L-vormige wolfraam draad is bevestigd aan een 1 ml spuit met behulp van niet-giftige klei of stopverf. (A) De elektrode eindpunt maatregelen 5 mm. (B) Bevestig een paar elektroden, zodanig dat de uiteinden parallel lopen. Elektroden zijn bevestigd aan pulsgenerator door DC kabels. Figuur 2 Elektroporatie kamer. (A) 90 mm schaal bekleed met plasticine is gevuld met media en een T-vormige kamer gesneden met een pincet nr. 5 horlogemaker's. (B) De lange zijde hoogte van 2 mm x 2 mm X10 mmterwijl de korte maatregelen 2 mm x 2 mm x 5 mm. Het hoofd van het embryo ligt in de T-splitsing, ventrale zijde naar boven. Figuur 3 Schematische illustratie van elektroporatie procedure. St. 28 kikkervisje is geplaatst in elektroporatie kamer, ventrale zijde naar boven. Micropipet wordt ingevoegd in het gezicht mesenchym onderliggende cement klier. Injecteren. Micropipet is verwijderd en L-vormige elektroden zijn opgelijnd parallel aan weerszijden van de kop. Van toepassing acht 50 ms, 20 mV vierkante pulsen. Schuif elektroden. Grow kikkervisjes naar de gewenste fasen. Visualiseer MO of GFP-expressie met behulp van fluorescentie microscopie. Figuur 4 vertegenwoordiger kikkervisjes 12 (A), 48 (B) en 96 (C) uur na de elektroporatie (fase 30, 34 en 44 respectievelijk). (A "-B"), TL-MO kan worden gevisualiseerd in craniofaciale mesenchym op hertes 30 en 34. Fluorescentie kan worden gedetecteerd in het kraakbeen in fase 44 (pijlpunt, C'-C "). De darm is zeer autofluorescente.