Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Bölüm 1A. Ekipman Mikroskop: düşük güç amacı ile dik stereo diseksiyon kapsamı Gerilim / Pulse Generator: BTX ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi Pipet çektirmesi: P-87 Mikropipet Çektirme (Sutter Instrument Company, CA) Manipulator: kaba, ya da kombine kaba ve ince hazırlık bağlı. Mikropipet sahibi: Güzel Bilim Araçları Elektrot: ev yapımı Elektroporasyon kamara: ev yapımı L-şekilli elektrotlar: Yüksek saflıkta 8 cm 0.4 mm tungsten tel (Goodfellow) ve orta noktasında yapıştırmayın kesin 1ml şırınga kullanarak bir macun (Blu-Tack). 4 cm tungsten tel L şekline bend ucu ve şırınga ucu açık bırakın, ucundan 1 cm (Şekil 1A). Ucu sonuna kadar uzunluğu 0.5 mm boyutlarında kesin. Tonun ucu elektrot uçtur. Şırıngaya aşırı tungsten tel paralel ve elektrot nabız jeneratörü bağlamak için onu kullanabilirsiniz. Bir çift elektrot verme işlemi tekrarlayın. DC kablolar üzerinden kare dalga darbe jeneratörü elektrotları takın. Elektroporasyon kamara Hat alt ~ 5 mm non-toksik hamuru ile 90 mm çanak. Elektroporasyon medya ile çanak doldurun. No: 5 saatçilik forseps T-şekilli bir kuyu (Şekil 2) bölmek. ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm ve kısa ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm uzun iyi ölçmelidir. Elektroporasyon bulaşık yıkanır ve tekrar kullanılabilir. Bölüm 1B. Reaktifler DNA veya tahsil makromoleküllerin Mikropipetler: 1 mm genişliğinde 4 "uzun borosilikat cam kapilerleri (TEFE, TW100-F) Kültür medya: Normal Amfibi Medya (NAM) > 10 X stoğu: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. 4 ° C'de Otoklav ve mağaza 1 X NAM: 10x stok, tampon 0.1 mM NaHCO 3 ve 0.2 mM Na 3 PO 4 ile seyreltilir. Xenopus laevis tetarlar, sahne 28 DNA hazırlığı: Ifade plazmid standart protokolleri kullanarak hazırlayın. Nükleaz serbest H 2 0 1 mcg / ml final konsantrasyonda DNA tekrar * PCS2 gibi güçlü bir CMV organizatörü içeren vektörler, başarı vardı + [16]. Soy analizi için, biz genellikle son bir 0.1 mg / ml konsantrasyonda yeşil floresan proteininin (pCS2 GFP) kodlayan DNA içerir. [0.1-3 mg / ml arasında DNA konsantrasyonları da test edildi. Biz bulduğu konsantrasyonları 0.8 mg / ml verimsiz etiketli hücre altında, daha fazla DNA konsantrasyonları ise 2 mg / mu; l elektroporasyon verimliliğini artırmak vermedi]. Morfolino oligonükleotid hazırlanması: (Not:. Pratisyenler fluoresceinated gerekir (3'-carboxyfluorescein değiştirilmiş) veya başka bir ücret) Süspanse edin morfolino oligonükleotidler (MOS) (Genetools, www.genetools.com nükleaz serbest H 2 0 2 mM konsantrasyonda). Isı kısım stok solüsyonu 65 ° C'de 5 dakika. Son konsantrasyonu 0.5 mM nükleaz ücretsiz su sulandırınız. * 0.1-1mm MO çözümleri test edildi. 0.5 mM MO çözümler birçok mezenkimal hücreler elektroporasyon için yeterli oldu. Mikropipetler Borosilikat cam kılcal damarlar (1 mm genişliğinde, 4 "uzun, TEFE yok. TW100-F) mikropipetler hazırlayın. Mikropipetler hazırlamak, 8-12 mm uzunluğunda konik ve ince uçlu iğne çektirmesi kullanın. Crush ucu ~ 2 mmucundan, forseps kullanarak pürüzlü bir duraklama. Medya Kuluçka medya: 1x stok taze 3 / 4 Normal Amfibi Medya (NAM) hazırlayın. 0.025 mg / ml gentamisin ekleyin. Elektroporasyon medya: yukarıdaki gibi,% 0.1 Benzocaine (Sigma, 06.950). 2. Elektroporasyon Mikropipet kurulum Mikropipet ~ 1 ul enjeksiyon solüsyonu ile doldurun. Mikromanipülatör mikropipet Güvenli ve mikroenjektör (Picospritzer II) ekleyin. Masa üstü ile 50 ° açı mikropipet. Enjeksiyon basıncı 20 PSI olarak ayarlayın. Puls başına 30 nl enjekte mikropipet kalibre edin. Tadpole hazırlık 5 dakika elektroporasyon medya kuluçka aşamasında 28 Xenopus larvaları anestezisi. Elektroporasyon medya ile dolu elektroporasyon odasına anestezi larva transferi. Pozisyonu embriyoUzun içinde baş, aşağı dorsal tarafına ve ventral tarafta maruz T kavşak aittir. Kafa, kuyruk göre biraz yüksek olmalıdır. Forseps kullanarak, hafifçe hamuru çevreleyen ile larva güvenli. (Not:. Larva güvenli değilse, seğirme ve elektroporasyon sırasında elektrot ile irtibata Bu durumda yüz dokular ciddi hasar görecek olması, tetra atmak) Elektroporasyon Mikropipet ucu hemen çimento bezi ve arka yüz mezenşimin içine yerleştirin. 30 nl çözüm mezenşimin içine enjekte edilir. Mikropipet geri çekin. Hızla embriyonun kafası (Şekil 3) paralel elektrot uçları aynı hizaya getirin. 8 50 ms, 20mV kare darbeleri uygulayın. Elektrotlar geri çekin. Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde larva serbest ve 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml gentamisin transfer. 3 / 4, NAM, 0.025 mg / ml overn tetarlar inkübe edilmelidir.ight, ya da daha uzun. 24 saat sonra floresan mikroskobu ile verimli elektroporasyon Ekran embriyolar. 3. Temsilcisi Sonuçlar: Floresan moleküllerin electroporated embriyoların kullanımı kolay tarama sağlar. Şekil 4 14.5 inkübe MO electroporated tetarlar ~ 12, 48 ve 96 saat sonra elektroporasyon tipik bir parti, ° C Floresan mikroskobu kullanarak, katille elektroporasyon sonra hemen görüntülenebilmekte ve elektroporasyon sonra birkaç gün süreyle devam edilebilir. Bizim tecrübelerimize göre, floresan aşamada 46 (~ 5 gün sonra) zayıf açıktır. Kıkırdaklar, floresan farklılaşma (~ St 42) başladıktan sonra dramatik bir şekilde azalır, ancak MO floresan gibi faringeal endoderm gibi diğer hücre tiplerinde daha güçlü devam. Floresan mikroskopi oligonükleotidler kıkırdak dahil olmak üzere birçok kraniyofasiyal dokular dahil olduğunu gösterir. Oligonükleotid floresans cgenellikle başın iki tarafında doku görüntülenebilmekte. Bu büyük olasılıkla elektroporasyon önce gevşek kraniyofasiyal mezenşimin boyunca enjeksiyon solüsyonu hızlı difüzyon nedeniyle. Şekil 1 Homemade elektrotlar. L-şekilli tungsten tel, toksik olmayan kil veya macun kullanarak 1 ml şırınga eklenir. (A) elektrot terminus, 5 mm. (B) Termini paralel olarak, bir çift elektrot takın. Elektrotlar DC kabloları ile darbe jeneratörüne bağlı. Şekil 2 Elektroporasyon kamara. (A) hamuru ile kaplı 90 mm çanak medya ve No 5 saatçilik forseps ile oyulmuş bir T-şeklindeki haznesi ile doludur. (B) uzun kenarı 2 mm X 2 mm X10 mm boyutlarındakısa önlemleri 2 mm X 2 mm x 5 mm iken. Embriyonun baş T-kavşak, ventral tarafta aittir. Şekil 3 şematik gösteren elektroporasyon prosedür. St 28 larva ventral yüzü yukarı, elektroporasyon odasında yerleştirilir. Mikropipet yüz mezenşimin yatan çimento bezi içine yerleştirilir. Enjekte edilir. Mikropipet kaldırılır ve L-şekilli elektrotlar kafa paralel yan hizalanır. Sekiz 50 ms, 20 mV kare darbeleri uygulayın. Elektrotlar geri çekin. Istenilen safhalarında tetarlar büyütün. Pratisyenler veya floresan mikroskobu kullanarak GFP ifade görselleştirin. Şekil 4 Temsilcisi tetarlar 12 (A), 48 (B) ve 96 (C) saat elektroporasyon (sırasıyla aşamaları 30, 34 ve 44). (A-B ") Floresan MO geyik kraniyofasiyal mezenşimin içinde görüntülenebilmektees 30 ve 34. Floresans aşamada 44 (ok ucu, C'-C ") az kıkırdaklar tespit edilebilir. Gut yüksek autofluorescent.