Electroporación de mesénquima craneofacial

Parte 1A. Equipo Microscopio: alcance vertical estéreo disección con el objetivo de baja potencia Tensión / generador de impulsos: BTX 830 ECM sistema de electroporación de onda cuadrada Pipeta extractor: P-87 Micropipeta Extractor (Compañía Sutter Instrument, CA) Manipulador: grueso, o combinarse gruesa y fina en función de la preparación. Titular de la micropipeta: Herramientas de Bellas Ciencia Electrodo: hechos en casa Electroporación de cámara: en casa Electrodos en forma de L: Cortar 8 cm de alta pureza 0,4 mm de alambre de tungsteno (Goodfellow) y colocará en el punto medio de una jeringa de 1 ml con masilla (usamos Blu-Tack). Deja 4 cm de alambre de tungsteno expuestos desde la punta de la jeringa y la punta curva en forma de L, de 1 cm desde el extremo (Fig. 1A). Recortar la punta para que el extremo mide 0,5 mm de longitud. Tsu punta es la terminal del electrodo. En paralelo el exceso de alambre de tungsteno a la jeringa y la utilizan para conectar el generador de impulsos del electrodo. Repita el proceso de hacer un par de electrodos. Conecte los electrodos al generador de pulso cuadrado de onda a través de cables de CC. Electroporación cámara Línea inferior de 90 mm plato con ~ 5 mm de plastilina no tóxica. Rellene plato con los medios de comunicación de la electroporación. Usando N º 5 pinzas de relojero hacerse un bien en forma de T (Fig. 2). El bien siempre debe medir ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm y el corto ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. El plato de electroporación se pueden lavar y reutilizar. Parte 1B. Reactivos ADN o macromoléculas cargadas Micropipetas: 1 mm de ancho, 4 "de largo capilares de vidrio de borosilicato (WPI, TW100-F) Los medios de cultivo: Normal Medios Anfibios (NAM) > 10 X stock: 1100 mM NaCl, 20mM KCl, 10 mM de Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. Autoclave y almacenar a 4 ° C. 1 X NAM: Diluir 10 veces desde el almacén de amortiguación, con 0,1 mM NaHCO 3 y 0,2 mM Na 3 PO 4. Renacuajos Xenopus laevis, etapa 28 Preparación del ADN: Prepare plásmidos de expresión a través de protocolos estándar. Resuspender el ADN a una concentración final de 1 mg / l en la nucleasa libre de H 2 0. * Hemos tenido éxito con vectores que contienen un fuerte promotor de CMV, como pCS2 + [16]. Para el análisis de linaje, por lo general incluyen el ADN que codifica la proteína verde fluorescente (GFP pCS2 +) a una concentración final de 0,1 mg / l. Concentraciones [de ADN entre 0.1-3 mg / l también fueron probados. Se encontró que las concentraciones por debajo de 0,8 mg / l células ineficiente etiqueta, mientras que las concentraciones de ADN de más de 2 mg / m yu, l no ha mejorado la eficiencia de la electroporación]. Morfolino oligonucleótidos preparación: (Nota:. OM deben ser fluoresceinado (3'-carboxifluoresceína modificados) o acusado de otro tipo) Resuspender morfolino oligonucleótidos (OM) (GeneTools, www.genetools.com ) a una concentración de 2 mM de nucleasa libre de H 2 0. Alícuota de la solución madre de calor a 65 ° C durante 5 minutos. Se diluye a la concentración final de 0,5 mM en agua libre de nucleasa. * 0.1-1mm soluciones MO fueron probados. 0,5 mM soluciones MO fueron suficientes para la electroporación de muchas células mesenquimales. Micropipetas Prepare micropipetas de vidrio de borosilicato capilares (1 mm de ancho, 4 "de largo, no WPI. TW100-F). Utilice extractor de aguja para preparar micropipetas con un cono 8-12 mm de largo y de punta fina. Aplastar a punta de ~ 2 mmde la punta con las pinzas, la creación de una ruptura irregulares. Medios de comunicación Medio de incubación: Preparar fresca 3.4 normal de Medios Anfibios (NAM) de 1x de valores. Añadir 0,025 mg / ml de gentamicina. Los medios de comunicación de la electroporación: como el anterior, con el 0,1% de benzocaína (Sigma, 06950). 2. Electroporación Micropipeta de configuración Rellene micropipeta con una solución inyectable ~ l. Seguro micropipeta en micromanipulador y se unen a microinyector (Picospritzer II). Micropipeta ángulo a 50 ° de la mesa. Ajuste la presión de inyección a 20 PSI. Calibrar micropipeta para inyectar 30 nl por impulso. Tadpole preparación Anestesiar etapa 28 larvas de Xenopus incubando en los medios de comunicación de la electroporación por 5 minutos. Transferencia de renacuajo anestesiado en la cámara de electroporación llena de medios de comunicación de la electroporación. La posición del embriónen el tiempo y modo que la cabeza se apoya en el cruce con la cara dorsal hacia abajo y la parte ventral expuesta. La cabeza debe estar ligeramente elevada en comparación con la cola. Con unas pinzas, suavemente seguro renacuajo bien en los alrededores de plastilina. (Nota:.. Si el renacuajo no está asegurada, puede contracción y contacto de los electrodos durante la electroporación En este caso, descartar el renacuajo como pañuelos de papel se verá seriamente dañada) Electroporación Inserte la punta de micropipeta inmediatamente posterior a la glándula de cemento y en mesénquima facial. Inyectar la solución de 30 nl en mesénquima. Retraer micropipeta. Alinear rápidamente puntas de los electrodos paralelos a la cabeza del embrión (Fig. 3). Aplicar 8 50 ms, legumbres 20mV cuadrados. Retraer los electrodos. El uso de pinzas cuidadosamente liberación renacuajo de bien y de transferencia de hasta 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml de gentamicina. Los renacuajos pueden ser incubados en 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml Overnight, o más. Seleccionar embriones para la electroporación eficiente mediante microscopía de fluorescencia después de 24 horas. 3. Los resultados representativos: El uso de moléculas fluorescentes permite la detección fácil de embriones electroporated. La figura 4 muestra un lote típico de MO electroporated renacuajos ~ 12, 48 y 96 horas después de la electroporación, se incubaron a 14,5 ° C. Mediante microscopía de fluorescencia, OM se puede visualizar inmediatamente después de la electroporación y persistir durante varios días después de la electroporación. En nuestra experiencia, la fluorescencia es débilmente evidente en la etapa 46 (~ 5 días después). En los cartílagos, la fluorescencia disminuye dramáticamente después de la aparición de la diferenciación (~ º 42), sin embargo, MO fluorescencia persiste con más fuerza en otros tipos celulares, como el endodermo faríngeo. Microscopía de fluorescencia muestra que los oligonucleótidos se incorporan en varios tejidos craneofaciales incluyendo el cartílago. Oligonucleótidos c fluorescenciaa menudo un ser visualizado en el tejido en ambos lados de la cabeza. Esto es probablemente debido a la rápida difusión de la solución inyectable en todo el mesénquima craneofacial sueltos antes de la electroporación. Figura 1 electrodos hechos en casa. En forma de L de alambre de tungsteno es conectada a una jeringa de 1 ml con no-tóxico de barro o masilla. (A) El término del electrodo mide 5 mm. (B) Coloque un par de electrodos, de modo que los extremos son paralelas. Electrodos se conectan al generador de impulsos a través de cables de CC. Figura 2 cámara de electroporación. (A) 90 mm plato forrado con plastilina está lleno de medios de comunicación y una cámara en forma de T tallada con fórceps No relojero de 5 años. (B) El lado más largo mide 2 mm x 2 mm X10 mmmientras que las medidas sólo 2 mm x 2 mm x 5 mm. La cabeza del embrión se basa en el cruce, la parte ventral hacia arriba. Figura 3 Esquema que ilustra el procedimiento de electroporación. St. 28 renacuajo se coloca en la cámara de electroporación, lado ventral hacia arriba. Micropipeta se inserta en la glándula de cemento facial mesénquima subyacente. Inyectar. Micropipeta se elimina en forma de L y los electrodos están alineados en paralelo que flanquean la cabeza. Aplicar ocho de 50 ms, 20 mV pulsos cuadrados. Retraer los electrodos. Renacuajos crecen en etapas deseado. Visualizar OM o la expresión de GFP mediante microscopía de fluorescencia. Figura 4 renacuajos Representante 12 (A), 48 (B) y 96 (C) horas después de la electroporación (etapas 30, 34 y 44, respectivamente). (A "B") MO fluorescente se puede visualizar en mesénquima craneofacial en el ciervoes 30 y 34. La fluorescencia se puede detectar en los cartílagos en la etapa 44 (punta de flecha, C '-C "). El intestino es muy autofluorescentes.