Craniofacial Knorpel entwickeln in engem Kontakt mit anderen Geweben und sind schwer zu lebenden Tieren zu manipulieren. Wir sind mit Elektroporation, um molekulare Werkzeuge während des Wachstums des kraniofazialen Skeletts liefern unter Umgehung der frühen Embryonalentwicklung Effekte. Dieser Ansatz erlaubt es uns, effizient Testkandidat Moleküle<em> In vivo.</em
Elektroporation ist eine effiziente Methode der Bereitstellung von DNA und andere geladene Makromoleküle in das Gewebe zu präzisen Zeitpunkten und in genauen Standorte. Zum Beispiel, Elektroporation wurde mit großem Erfolg verwendet worden, um Nerven-und Retina-Entwicklung in Xenopus-Studie, Huhn und Maus 1-10. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass in all diesen Studien, Ermittler wurden nicht gezielt Weichteile. Weil wir in kraniofazialen Entwicklung interessiert sind, passten wir eine Methode zur Gesichts-Mesenchym Ziel.
Wenn wir die Literatur gesucht, fanden wir zu unserer Überraschung, nur sehr wenige Berichte über erfolgreiche Gentransfer in Knorpelgewebe. Die meisten dieser Studien waren Gentherapie-Studien, wie siRNA oder Proteinen Lieferung in chondrogene Zelllinien, oder Tiermodellen von Arthritis 11-13. In anderen Systemen, wie Huhn oder eine Maus, die Elektroporation von Gesichts-Mesenchym war eine echte Herausforderung (persönliche KommunikIonen, Dept of Craniofacial Development, KCL). Wir stellten die Hypothese, dass Elektroporation in procartilaginous und knorpeligen Gewebe in Xenopus könnte besser funktionieren. In unseren Studien zeigen wir, dass Gen-Transfer in die Gesichts-Knorpel tritt effizient in einem frühen Stadium (28), wenn das Gesicht Primordium noch von Weichgewebe umfasst vor Knorpel Differenzierung.
Xenopus ist ein sehr zugänglicher Wirbeltier-System für die Analyse von kraniofazialen Entwicklung. Kraniofazialen Strukturen sind gut sichtbar in Xenopus als in jedem anderen Wirbeltier-Modell, vor allem weil Xenopus Embryonen extern befruchtet werden mit Hilfe von Analysen der frühesten Stadien, und die Erleichterung leben Bildgebung bei einzelnen Zelle Auflösung, sowie die Wiederverwendung der Mütter 14. Unter Wirbeltieren Modelle entwickeln extern, ist Xenopus mehr nützlich für die kraniofaziale Analyse als Zebrafisch, wie Xenopus Larven größer und leichter zu dissect und die Entwicklung von Gesichts-Region besser zugänglich zu Bildgebung als die entsprechende Region in Fisch. Darüber hinaus ist Xenopus evolutionär näher an den Menschen als Zebrafisch (~ 100.000.000 Jahre näher) 15. Schließlich in diesen Phasen sind Xenopus Kaulquappen transparent, und die gleichzeitige Expression von fluoreszierenden Proteinen oder Molekülen wird eine einfache Visualisierung der Entwicklung von Knorpeln zu ermöglichen. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz wird es uns ermöglichen, schnell und effizient Testkandidat Moleküle で einem in vivo Modellsystem.
In diesem Video haben wir die Machbarkeit der Elektroporation-vermittelte Gentransfer in die Gesichts-Mesenchym von Xenopus Kaulquappen nachgewiesen. Mit diesem Ansatz können wir umgehen frühen Entwicklungsstadium Einfluss der Manipulation von Gen-Funktion ermöglicht es uns, spezifische Gewebe zu späteren Zeitpunkten Ziel. Unsere Studien zeigen, dass heterogene Populationen von kraniofazialen mesenchymalen Zellen beeinflusst werden kann, so dass wir Abstammung elektroporiert Zellen sowie Zell-autonome Anforderungen für Proteine von Interesse zu untersuchen. In Kombination mit Live-Bildgebung können wir mit diesem Ansatz Genfunktion Studie über die Zeit, während der kraniofazialen Entwicklung. Dieses neuartige Verfahren hebt die Lenkbarkeit des Xenopus für das Studium der Organogenese. Wir gehen davon aus, dass diese Methode im Großen und Ganzen kann angepasst werden, um Morphogenese und Differenzierung von anderen Geweben sowie zu studieren.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar, dass Nancy Papalopulu und Boyan Bonev für die Unterstützung bei Xenopus Elektroporation. Wir danken auch Marc Dionne für die kritische Durchsicht, Jeremy Green und John Wallingford für hilfreiche Diskussionen und die Mitglieder des Liu-Labor für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem BBSRC (BB/E013872/1) und dem Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) zu KJL finanziert.