Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3'UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

Introducción Los microARNs se han convertido en importantes reguladores de la expresión de genes que modulan la actividad de muchos procesos biológicos importantes. Con más de 700 miRNAs humanos identificados hasta la fecha 1, no es sorprendente que las mutaciones y la regulación inadecuada de los miRNAs se han relacionado con una variedad de desórdenes fisiológicos como el cáncer y las enfermedades del corazón 2,3. Estudios recientes han demostrado que la mayoría de los sitios de unión reguladores miRNA se encuentran en 3'UTRs 4,5, y algunos investigadores han estimado que hay cientos de objetivos por miRNA en la de 6 celdas. Dada la importancia biológica de miRNAs, el gran número de miRNAs que existen y el gran número de objetivos para cada una de ellas, es fundamental que los investigadores son capaces de identificar de forma fiable los objetivos de miRNAs endógenos, de preferencia en plataformas susceptibles de alto rendimiento estudios. Mientras que la utilización de herramientas computacionales como miRBase, TargetScan y PicTar 1,6,7 es una forma poderosa para generar listas de mRNA objetivos putativo de cualquier miRNA, las predicciones no son lo suficientemente precisos para confiar en ella solo 8. Por lo tanto, los investigadores también aprovechar una serie de enfoques experimentales para identificar los objetivos de novo o para validar los objetivos previstos. Muchos equipos se han basado en medidas de alto rendimiento del estado de equilibrio los niveles de ARNm y proteínas para identificar los genes para que los cambios de expresión cuando la actividad miRNA es perturbada 4,9,10. Estos cambios son, sin duda, biológicamente significativas y representan un primer paso importante, sin embargo, la medición de cambios en la expresión general no distingue entre efectos directos de un miRNA en la transcripción y los efectos indirectos de señalización o aguas abajo. Otras herramientas de gran alcance que proporcionan evidencia directa de ARNm-miRNA interacciones son la cromatina immunoprecipitation (CHIP) estrategias que vinculen cruzada proteínas Argonauta (y por lo tanto el complejo RISC) para miRNAs y ARNm, aunque la identificación de los socios que interactúan no indican de inmediato los efectos funcionales de un evento tan vinculante 5,11. Por lo tanto, el reportero 3'UTR-ensayos que proporcionan pruebas funcionales para el efecto un miRNA en un determinado UTR se han convertido en un componente importante de un estudio a fondo miRNA. Tales células de datos basado en ensayo en conjunto con las predicciones de destino de cálculo o expresión y datos de la proteómica proporciona una fuerte evidencia de que un 3'UTR particular es directamente regulada por el miARN de interés. En un ensayo de 3'UTR-reportero, la 3'UTR de un gen de interés se fusiona con el fin de un gen reportero de luciferasa. Si el 3'UTR es un objetivo de un miRNA, la estabilidad transcripción reportero y / o la eficiencia de traducción va a cambiar con la variación en la concentración de miRNA funcional. Así que a diferencia de la transcripción de sólo basadas en ensayos, los ensayos de reportero ayudar a identificar problemas en ambos ARNm de estado estable y los niveles de proteína. Sistemas reportero también puede ser usado para estudiar los efectos funcionales de un sitio de mutagénesis miARN putativo de unión en una 3'UTR para confirmar que sí es necesario para la interaction8. Y si bien estudios a gran escala utilizando arrays de expresión, las técnicas de proteómica y chip Argonaute proporcionar valiosos datos en todo el genoma de un pequeño número de condiciones experimentales, ensayos basados ​​en células periodista son los más susceptibles de ampliación para el estudio de miRNA-3 ' interacciones UTR en cientos o miles de condiciones que puedan resultar necesarias para la selección de alto rendimiento de pequeñas moléculas u otros efectores basados ​​en la biblioteca. Muchos científicos han aplicado la tecnología reportero de ensayo para el estudio de las interacciones 3'UTR miRNA. Sin embargo, con la idea de que muchos miRNAs cada cientos de destino de las transcripciones diferentes, ha sido difícil para los investigadores que utilizan este método de gran alcance en una escala de alto rendimiento debido a los pasos de la clonación, la validación y la optimización para la creación de miles de diferentes 3'UTR- vectores reportero son a menudo un coste prohibitivo. En un esfuerzo para que la pequeña y gran escala reportero 3'UTR estudios al alcance de cualquier investigador, hemos creado una colección de todo el genoma de los humanos 3'UTRs pre-clonado en el sistema altamente optimizado LightSwitch ensayo de luciferasa. El sistema también incluye reportero validado vectores de control, un conjunto de más de 700 construcciones de miRNA sintéticos reportero objetivo para su uso como controles positivos, y una serie de protocolos experimentales estandarizados. Utilizando el siguiente protocolo, se puede preguntar si un 3'UTR humano en particular es un objetivo de miRNA de interés. Los pasos críticos en el flujo de trabajo son el diseño experimental, la transfección de reportero construye y reproduce miRNA, ensayos de luciferasa reportero, y análisis de datos. Para el diseño experimental, es importante seleccionar cuidadosamente una línea celular transfectable, reportero construcciones experimentales y de control, e imita miRNA y los controles no objetivo. Comunes altamente transfectable adhlíneas celulares como erent HT1080, HepG2, HCT-116, Hela, 293, y otros a menudo funcionan bien con este protocolo. Notas importantes en el diseño experimental El sistema de ensayo Luciferase LightSwitch es un sistema reportero totalmente optimizado que incluye construcciones GoClone utilizando el gen de la luciferasa RenSP y reactivos LightSwitch luciferasa de ensayo. Utilizar todos los componentes del Sistema de LightSwitch como se recomienda para obtener óptimos resultados reportero de ensayo. Co-transfección de los oligos / plásmidos con construcciones de conmutación reportero GoClone reduce en general las señales de la luciferasa de una manera no específica. Por lo tanto, es importante llevar a cabo la transfección combinaciones siguientes: único periodista, el reportero + no de metas de miRNA de control, y el reportero + miRNA específico. Nuestro vector empty_3UTR (promotor fuerte, no UTR) proporciona un alto nivel de la señal de luciferasa y sirve como un control positivo de la eficiencia de transfección, y un objetivo sintético miRNA vector reportero puede servir como un control positivo para imitar la actividad. Además, se recomienda utilizar los controles GoClone 3'UTR de limpieza y controles aleatorios para separar con precisión la secuencia específica frente a los efectos no específicos. Estudio de su protocolo, y siempre que sea posible hacer mezclas maestras para disminuir la variabilidad en los datos debido a un error de pipeteo o evaporación. Este protocolo utiliza DharmaFect reactivo de transfección Duo (Dharmacon). Día 1 CONSEJO IMPORTANTE: Elige tu línea celular inteligente. Para obtener los mejores resultados, utilice una línea celular que se sabe que es transfectable. También hemos encontrado que la respuesta medible de un reportero de 3 'UTR de un miRNA mímica se atenúa en las líneas de células con altos niveles endógenos de que miRNA particular. Si usted no sabe la cantidad de miRNA su línea celular expresa, intente objetivo microARN sintéticos SGG, que mide indirectamente la abundancia de un miRNA particular en una célula, así como para informarle sobre el rango dinámico de su ensayo. 1. Las células para producir semillas de ≥ 80% de confluencia en el momento de la transfección. Las células de las semillas en un 96-así placa blanca TC en el volumen total de 100μl. En la semilla en paralelo, el número adecuado de células en una placa transparente de 96 pozos de evaluación de confluencia. CONSEJO IMPORTANTE 1: Confluencia es clave para lograr buenos resultados en un experimento de imitar. De caída óptima, las células deben ser 100% confluentes en el momento de la transfección. CONSEJO IMPORTANTE 2: Utilice las células bajo el paso para obtener mejores resultados. Células que han sido pases muchas veces tienden a dar los datos ruidosos transfección. Día 2 Prepare las construcciones GoClonereporter y miRNAs, entonces transfectar a las células confluentes. 2. Prepare Construye Constructos deshielo GoClone (ADN plásmido) a temperatura ambiente. Mezclar bien. Centrífuga para eliminar la condensación de la tapa. 3. Prepare micro RNAs Descongele los microRNAs (imita y controles específicos no objetivo) a temperatura ambiente y centrifugar para eliminar la condensación de las tapas. Diluir a una concentración de trabajo de 2 M en agua libre de RNasa. Además de un miARN experimental imitar siempre incluyen un control de miRNA no objetivo. Co-transfección de un plásmido y un pequeño ARN oligo conduce a la disminución de la señal de la transfección del plásmido solo. Incluir uno o más controles positivos. Considere el uso de uno de los cientos de vectores sintéticos miRNA reportero objetivo en el catálogo de la SGG. Incluir uno o más controles negativos o no específicas. SGG tiene una serie de controles de los cuales 3 'UTRs de los genes de limpieza, los fragmentos al azar y / o el control de vacío (sin inserto UTR). El uso de uno o más de estos controles junto a una construcción experimental le permitirá normalizar los efectos no específicos atribuibles a la sobre-expresión de su miRNA específico o la falta de control de orientación. 4. Prepare transfecciones Para cada transfección se combinan los siguientes reactivos de un único ensayo: Mezcla 1 Individuales reportero GoClone: 3,33 l microRNA: Varía * Medio libre de suero: a 10 l * La concentración efectiva de los miRNA puede variar de 10 nm-100 nm. Consulte al fabricante miRNA para la concentración apropiada. CONSEJO IMPORTANTE: No agregue demasiado imitar. Un rango razonable para imitar las concentraciones es 10-50 nm en la reacción 100uL final. Realizar al menos tres réplicastransfecciones te para cada tratamiento / UTR combinación e incluyen un volumen adicional para permitir la pipeta de error. Por ejemplo, multiplicar los volúmenes de reacción solo un 3,5 para obtener la mezcla de transfección para 3 pozos de transfección replicar incluyendo adicionales que permitan tomar error o evaporación. Por cada reportero, creado réplicas de los siguientes: único periodista, el reportero + no de metas de control y miRNA reportero + miRNA específico. Establecer transfecciones para el microRNA objetivo al mismo tiempo que para un control sin orientación. Conforman el DharmaFECT DUO (Dharmacon) mezcla de la siguiente manera para cada uno de transfección: Mezcla 2 DharmaFect Duo: 0,15 l Medio libre de suero: 9,85 l La cantidad de DharmaFECT Duo a añadir puede ser la línea celular dependiente. Las cantidades indicadas son apropiadas para las células HT1080. Consulte la documentación del fabricante para determinar la cantidad adecuada para su línea celular. Consejo: Haga una mezcla de transfección grandes multiplicando el volumen por encima de por el número de periodistas, el número de repeticiones y el número de miRNAs para ser probados. Al calcular el importe de la mezcla de transfección de preparar, asegúrese de incluir una pequeña cantidad adicional para tener en cuenta los errores de pipeteo y evaporación. Dejar que la mezcla Duo DharmaFECT a incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de 5 minutos, añadir 10μL de la mezcla Duo DharmaFECT (Mezcla 2) a cada tubo ya preparado de 10 ul plásmido y / o miRNA (Mezcla 1). Cada tubo debe contener un volumen de 20μL por transfección replicar. Incubar cada mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de 20 minutos, añadir 80 l de pre-calentado (37 ° C), libre de antibióticos, los medios de comunicación completa por replicar a cada tubo para un total de 100μL por transfección replicar. Un bloque de pozo profundo puede ser utilizado para la preparación de muchas repeticiones y las muestras de forma simultánea. Mezclar la solución con la pipeta hacia arriba y abajo. Retire la placa de cabeza de serie de la incubadora. Compruebe que los elementos son al menos el 80% confluente. Cuidadosamente con pipeta de los medios de comunicación de cada pozo. Añadir 100μL de la mezcla de transfección (20 ul de ADN / reactivo mezcla + 80uL los medios de comunicación) a cada pocillo. Coloque la placa en la incubadora durante la noche. No se exceda en incubar. La mayoría imita producirán resultados significativos en bona fide objetivos dentro de las 24 horas. El nivel de represión medible en 48 horas puede ser mayor, pero también lo hará el bien a la variabilidad del bien. Imitar los experimentos son más fáciles que los experimentos inhibidor. Mientras que la mayoría imita significativamente reprimir verdaderos objetivos dentro de las 24 horas, importantes de la represión atribuibles al inhibidor puede tomar 48 horas para ser medibles y casi siempre será menos pronunciado que el efecto de la mímica. Día 3 Nota: Los ensayos de luciferasa puede llevarse a cabo inmediatamente o las placas pueden ser congelados a -80 ° C (congelación generalmente se incrementa la lisis celular y la señal de luciferasa). Congelar y descongelar las células antes de ensayar para obtener mejores resultados. Recuerde dejar descongelar las células congeladas a temperatura ambiente antes de añadir LightSwitch ensayo. 5. Medir la actividad luciferasa con AssayReagents LightSwitch Retire la placa de la incubadora y llevar a temperatura ambiente. Preparar los reactivos LightSwitch ensayo (kit para LS010, los protocolos de los tamaños de otro kit se pueden encontrar en línea): Sustrato 100X reconstituir añadiendo 100μL de sustrato solvente a un tubo de ensayo del sustrato liofilizado. Proteger de la luz y minimizar el tiempo a temperatura ambiente. Sustrato 100X se pueden almacenar a-20C por 2-tres semanas. Para mejores resultados, el uso de sustrato, una vez reconstruido. Prepare la solución de ensayo por el deshielo botella de 10 ml de tampón de ensayo en un baño de agua a temperatura ambiente y añadir 100μL de sustrato 100X reconstituido antes de su uso. Mezclar bien. Use una pipeta multicanal para añadir 100μL de solución de ensayo LightSwitch (buffer + sustrato) directamente a cada muestra (que contiene células 100uL + medios de comunicación) en un plato blanco de 96 pozos. Si las células se cultivaron en otra placa o en formato botella, la transferencia de muestras a un plato blanco de 96 pozos en el volumen total de 100μL (medios de comunicación o PBS). Cubierta de la placa, protegerlo de la luz, y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. Si ensayar más de una placa, escalonar Además de la solución de ensayo de modo que cada placa se incuba durante 30 minutos antes de la lectura. Lea cada bien durante 2 segundos en una placa de luminariasnometer (SpectraMax L o equivalente). Calcular la caída mediante el cálculo de la relación señal luciferasa para construir cada uno de miRNA específico sobre la falta de control de orientación (luminiscencia = miARN específicos / no de metas de control). Utilizar los datos de la limpieza, al azar, y las construcciones vacías para el control de no-UTR los efectos del tratamiento específico. Resultados representante Objetivos 3'UTR en la presencia de un miARN objetivo mostrar caída luciferasa. La caída de la actividad de reportero 3'UTR-luciferasa por el let-7a se midió en las células HT1080 por la co-transfección de 100 ng de cada reportero construir con 20nm que-7a control de imitar o no objetivo, período de incubación de 24 horas, luego de leer el reportero luminiscentes señal utilizando reactivos LightSwitch luciferasa de ensayo. Figura 1. 3'UTRs punción y ARID3B humanos son los blancos de los micro ARN let-7a. Las señales de los periodistas 3'UTR humanos para la punción y genes ARID3B son significativamente derribado en la presencia de los micro ARN let-7a imitar mientras que las señales para la limpieza y orden aleatorio UTRs no lo son.