1. Adım 1 – kardiyomiyosit izolasyon Aşağıdaki gibi sindirim tampon hazırlayın: 10 x Sindirim Buffer (ultra-saf H 2 O yapılan) Final Conc. g / L g/500 mL 10x çözüm g / L NaCl 130 mm 7,597 3,3 75,97 KCl 5 mM 0,4 0,2 4,0 Pirüvik asit 3 Nm 0,33 0,165 3,30 Hepes 25 mM 5,96 2,85 59,6 MgCl 2 0.5 mM 0,101 0,05 1,01 NaH 2PO 4monobasic 0.33 mM 0,04 0,02 0,40 Dekstroz 22 mm 3,96 1,98 39,6 NaOH ile pH tampon 7.4 10x Sindirim Tampon kullanarak, (ultra saf H 2 O) perfüze olacak her kalp için aşağıdaki dört çözümler olun: Sindirim Tampon A (üç alikotları bu çözümleri olun) 50 ml içeren 1x Sindirim Tampon: McL 75 – EGTA çözüm (100 mM EGTA) Sindirim Tampon B (bunlardan biri olun.) 25 ml içeren 1x Sindirim Tampon: 1.25 mcL – CaCl 2 Çözüm (1 M) 1 mg – Proteaz 25 mg kollajenaz (can de ** = 18,75 mg bu miktarın% 75) Koleksiyon Tampon (bunlardan biri olun.) 2.5 mL içeren 1x Sindirim Tampon: 1.25 mcL – CaCl 2 Çözüm (1 M) 0.5 mg – Proteaz 15 mg kollajenaz (% 75 = 11,25 mg) ** 125 mg – BSA Nötralizasyon Yıkama Tamponu (bunlardan biri olun.) 25 ml içeren 1x Sindirim Tampon: 6.25 mcL – CaCl 2 Çözüm (1 M) 250 mg BSA ** Kollajenaz kaynak ve toplu bağlı olarak, enzim aktivitesi değişebilir. Bu aşırı-sindirim önlemek için bu tampona eklenen enzim miktarını optimize etmek için gerekli olabilir. D önceden açıklanan izolasyon sistemi kurunSindirim Buffer üç 15 ml bardak ile 1,2 etail buz üzerinde, biri 50 ml tüp Sindirim Tampon A ve (Sindirim Tampon hattı üzerinden en az 5 ml yıkanmalıdır perfüzyon için hazır 25 ml Sindirim Tampon B sistem üzerinden çalıştırmak), Koleksiyon Tampon sıcaklığı 37 ° C ve Nötralizasyon Yıkama Tamponu RT yükseltmek için bir su banyosunda ısındı. Perfüzyon kanülü kalp kanül üst kısmının etrafında düğüm soğuk Sindirim Tampon A. ile gevşekçe bazı sütür (4-O 6-O boyutu) temizlenmeli ve perfüzyon ucuna bağlanmış olacak ve diseksiyon çanak doldurun. Bu, daha sonra aort kalp kanül kapalı kaymasını önlemek için tutmak için kullanılır. Ölümcül oturaklı, anestezik ajan (0.25 ml sodyum pentobarbital çözüm) bir IP enjeksiyonu ile fare ve fare sağlamak, bilinçsiz ve ağrı uyaranlara yanıt vermeyen. Diyafram keserek göğüs kenarı boyunca göğüs boşluğu dikkatlice kesilerek açılır.(Şekil 2). Yukarı süperiora kesin ve (bu kesiler sırasıyla Şekil 2, B ve A belirlenir) ön göğüs kafesi yansıtacak Kritik – fare hala bu kesiler önce nefes olmalıdır. , Plastik bir pipet kesim boyutu kullanarak, kalp pipet yavaşça emer. Göğüs boşluğunun yeterli aort aort dalı (Şekil 3) net bir şekilde belirlemek için kalp bırakmak dikkatli olmak kalp kesin. Kalbe az hasara neden olur bu yana bir pipet kullanılır. Bırak, buz gibi Sindirim Buffer bir behere kalp ve kan uzakta durulayın. 15 sonra buz Sindirim Tampon ikinci behere 45 sn yerde kalp kısaca tekrar durulama. Ayrıca soğuk Sindirim Tampon A. ile dolu petri kalp transfer Diseksiyonu kapsamında Sindirim Tampon çanak kalp ve aorta ve dalları dikkatlice izole. Dikkatle son bayileri sadece alt Döşemeh (Şekil 4). Fit aort içine kanül ucu ve 4-O bir diseksiyon mikroskobu altında sahne kurulumu kullanarak 6-O sütür içinde Arter. Kanül çok düşük aort içinde oturmak ve koroner arterler (Şekil 4) yukarıda kalır değildir ki emin olun. Sindirim Tampon A perfüzyon kurulum akan ile kurulum perfüzyon ucu ve kan çoğunluğu kalp açık bırakarak kalp ve sıvı yıkanır kadar kalp serpmek başlar. Kritik – perfüzyon sıvısının sıcaklığı mümkün olduğunca yakın 37 ° C olmalıdır kateter çıktığında. Çözüm çok sıcak veya çok soğuk ise, perfüzyon doku öldürecektir. Kalp perfüzyon kadar zaman da önemlidir. Perfüzyon başlayana kadar zaman penceresi kalp kaldırılması 5-10 dakika daha az olmalıdır. Kalp, anestezi altında kaldırılır, CO 2 affixation veya servikal dislokasyon olmamak gerekir . Bir kez kan oldukalpten hed, Sindirim Tampon B kalp akan olduğunu Sindirim Tampon A. Sindirim Tampon B geçmek olun. Çözüm sarı bir renk tonu var başlayacaktır. Kalp şeklini kaybetme belirtileri gösterir ve sindirim çalışma olduğunun bir göstergesidir yuvarlak bakmak başlayıncaya kadar 2-3 dk bekleyin. Miyokardın perfüzyon ilerledikçe hafif görünmelidir. 37 Koleksiyon Tampon 15 mL içeren 50 ml konik boru makası ve yer ile ventriküller Cut off ° C Koleksiyon Tampon doku yerleştirerek yavaşça, küçük parçalar halinde ventrikül kesin. Hücre-hücre yapışıklıklar çözülür ve tek bir hücre kardiyomiyosit karışımı yapmak için plastik bir pipet yardımıyla yavaşça karıştırın. En doku çözülür, büyük doku parçaları dibine çöken (1 dakikadan daha az). 15 ml konik boru süpernatantı alın ve kaydedin. Gravite, 10 ila 20 dakika (15 üzerinden süpernatantı bir pelet çekin.min oda sıcaklığında) tercih. Süpernatantı çıkarın ve atın. Pelet pelet Nötralizasyon Yıkama Tamponu 5 ml ekleyerek ve onları tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe karıştırın yıkayın. Bu noktada hücreler hemen tek bir hücre analizi (2. adıma geçin) için seçilecek hazırız. 2. Adım 2 – tek hücre izolasyonu Alev ve hücreleri manipüle etmek için kullanılan bir cam kapiller tüp kullanan bir mikromanipülatör hazırlayın. Mikromanipülatör sonra taşımak ya da emme uygulanan hücreleri pick up esnek borular uzun bir parça bağlı çok ince kılcal tüp. Hemen çekilmiş bir pipet ve tek hücre örnekleri örnek aktarılıyor malzeme önlemek için bir hava kilidi ile oluşturulan bir mikromanipülatör kullanarak (Nikon Eclipse TS100, 20x) mikroskop altında tek tek hücrelerin seçimi geçin. Hücre popülasyonu sağlıklı olduğundan emin olun(% 70 yaşayabilir) ve izolasyon süreci zarar veremez. Bireysel olarak seçilmiş olabilir, böylece küçük bir Petri kabındaki hücreler aşağı seyreltilir. Toplama hücreleri küçük hacimli (2 mcL az) hücreleri yakalamak için emin olun. Ayırt edici normal kardiyomiyosit morfolojisi (Şekil 5) sadece sağlıklı hücreleri seçin. Tek tek hücrelerin tek tek PCR tüpleri dibine yerleştirin ve kuru buz üzerinde hemen dondurmak. Bu hücreler, gen ekspresyon analizi için kullanılacak ° C 'ye kadar sonra -80 saklanır. 3. Adım 3A – Tek hücreli qPCR gen ekspresyonu (Advance Geliştirme Protokolü # 30 Fluidigm) 3,4 tek hücre qPCR gerçekleştirmek için tek bir hücre gen ekspresyon Biomark Nanofluidic qPCR diziler için Fluidigm Corporation tarafından geliştirilen bir uyarlanmış bir protokol kullanır. Özel Hedef Amplifikasyon (RT-STA) – Ters transkripsiyon hazırlanması. Olmak içincin, 1x DNA süspansiyon tamponu (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) 100 mcM ilgi genler (125 kadar primer çiftleri başarıyla kullanmıştır) tüm primer çiftleri tekrar süspansiyon haline getirin. Birleştirin ve her bir deney için 20 mcM daha ileri ve geri primer çiftleri sulandırmak. Son olarak, RT-STA tepki olarak yükseltilecek her bir deney için 200 nM son bir konsantrasyon ile bir çözüm tüm primer çiftleri sulandırmak. Bunu yapmak için, her bir primer çifti ve 1:100 onları sulandırmak. Örneğin, 20 mcM az 30 tahlil primer çiftleri varsa, her bir çifti (30 mcL toplam) 1 mcL eklemek gerekecektir ve ardından finale 70 mcL DNA süspansiyonu tampon ile, birimin kalan makyaj 100 mcL seyreltme hacmi. Astar çözümler hazırlanır Şimdi, RT-STA reaksiyonu ana karışımı bir araya getirin. Yeterli yükseltmek isteyen tek tek hücrelerin her biri için ana karışımı hazırlayın. Reaktif McL hacmi (ortalama tepki) 2x Reaksiyon karışımı CellsDirect 5,0 Üst Simge III RT Plantinum Taq mix 0,2 RT-STA Primer karışımlar (200 nM her bir deney) 2,5 Nükleazlar H 2 O (veya 1x DNA süspansiyon tampon) 1,3 Toplam 9,0 Tablo 1: RT-STA master miks Hemen hücrelerinin, tüpün alt kısmında konumlandırılmış olduğundan emin olmak için 30 saniye için maksimum RCF donmuş hücreleri ve santrifüj kaldırmak. Tüp 9 mcL RT-STA karışımı ekleyin ve bir PCR reaksiyonu devam edin. 50 ° C – 15 dakika 95 ° C – 2 dakika 18 döngüleri 15 saniye boyunca 95 ° C 604 dakika ° C 4 tutun ° C Tüpleri PCR makineden çıkarın ve reaksiyon ExoSAP-BT 4 mcL ekleyin. ExoSAP-BT, RT-STA reaksiyon aşırı astar ve enzim kaldıracak bir PCR temizleme reaktif. PCR makine aşağıdaki reaksiyon ile tüpler çalıştırın. 37 ° C – 15 dakika 80 ° C – 15 dakika 4 tutun ° C ExoSAP-IT tedavi tamamlandığında, DNA süspansiyon tamponu ile örnekleri 01:05 sulandırmak. Örnekleri şimdi qPCR analizi için hazırlanmıştır. Biz Fluidigm Gen ekspresyonu qPCR Diziler (48,48, 96,96 plakaları) ile birlikte bu malzeme kullanıyoruz. Ayrıca bu yaklaşım daha geleneksel qPCR enstrümantasyon (96 veya 384 iyi formatları) ile kullanmak da mümkündür. Ancak, bu araçların genellikle p testlerinin sayısını sınırlar çok daha fazla örnek giriş gerektirirtek bir hücre erformed. 3. Adım 3B – tek hücre Tüm transcriptome amplifikasyon ve mikroarray Ekstraksiyon ve Amplifikasyon Sigma'nın WTA2 kiti (Cat # WTA2), pelet ve tek hücreleri hem de çift zincirli cDNA yükseltmek için kullanın. Tek hücreler Sigma'nın WTA2 protokol üreticinin talimatlarına göre ilk adımı ile "çıkarılan" dir. Bu ilk adım sırasında 37 kütüphane sentez tamponu ile inkübasyon ° C 5 dakika tek hücre zarı ve amplifikasyonu için mesaj "özler" bozar. Sigma-Aldrich WTA2 kiti kullanarak, iki turda tek hücre artırın. Üretici protokolüne göre kütüphane hazırlık adımı gerçekleştirir; WTA2 amplifikasyon 70 mcL kütüphane örnek eklemek 1 / 5 Master Mix. 25 devir için önerilen bisiklet parametreleri kullanarak örnekleri artırın. Örnekleri Purify USIng Qiagen QIAquick PCR Arıtma Kiti (Cat # 28.104) ve "Temizleme QIAquick PCR Amplifikasyon Reaksiyonlar Standart V4" protokolü kullanarak Qiagen Kullanıcı Qiacube süreci. Hız vakum kullanarak saflaştırılmış örnekleri, 5 mcL Konsantre ve 17 döngüleri (WTA2 amplifikasyon protokolü ve bisiklet parametreleri tekrarladı) amplifikasyon ikinci turda geçiriliyor. QIAquick PCR Arıtma Kiti kullanarak örnekleri arındırmak ve üreticilerin protokole göre NanoDrop spektrofotometre ve Agilent BioAnalyzer DNA 7500 kiti kullanılarak kalite kontrol. Etiketleme ve NimbleGen Gen İfade Diziler Etiket 2 mg çift NimbleGen Bir Renk Etiketleme Kiti (Cat # 05223555001) kullanarak her bir üretici protokolüne göre amplifiye hücre örneği cDNA mahsur. Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Diziler (Cat # 05543797001) göre 5 mg Cy3 etiketli örnek melezleşmeüreticinin protokolü Ording. Dizilerin örnekleri hibridizasyon sonra, slaytlar sonra yıkanır ve bir lazer tarayıcı görüntülü önce kurutulmuş olmalıdır. Bir lazer tarayıcı kullanarak tarama Gen İfadesi Diziler. Burada, Moleküler Cihazlar GenePix 4200A ayarları ile 100POW, Tarayıcı, ve 300-350PMT kullanın. Sonra NimbleGen NimbleScan yazılımı kullanarak her bir dizi için çift dosyaları oluşturmak ve daha sonra her bir tek hücre dizisi (tipik stabil bir şekilde ifade kardiyomiyosit transkript bir tablo, bir ek olarak dahil edilir; Tablo S1) tüm transcriptome ifade analiz. Kalp perfüzyon iyi çalıştı, izolasyon üzerine tipik dikdörtgen morfolojisi korumak sağlıklı kalp hücrelerinin yüksek bir oranda olması gerekir. Perfüzyon devam etmedi sonra ölü hücreleri büyük bir yüzdesini (Şekil 5 görüntülerini) olacaktır. Hücrelerin doğru ya WTA2 veya RT-STA yöntemleri kullanılarak güçlendirilirn son ürünleri NanoDrop ve BioAnalyser (Şekil 6) mRNA numunelerin kalite sonraki kalite kontrol testleri geçmelidir. Mikroarray iş akışı için, bu mRNA hem NanoDrop ve Bioanalyzer tarafından test WTA amplifikasyon sonra tamamlanır. Bu analiz Temsilcisi olumlu sonuçlar Şekil 6'da gösterilmiştir. WTA2 örnekleri NanoDrop spektrofotometre okuma, Bioanalyzer (BA) yonga (Şekil 6) yanı sıra Elektroferogram okuma hem de sağlam bir amplifikasyon göstermelidir. Stably tek hücre mikroarray aracılığıyla tespit edildi genlerin bir tablo (Tablo S1) bir örnek olarak yer almaktadır. QPCR süreci için, veri kalitesi, primer setleri istenilen ürünü (Şekil 7) yükseltme olduğundan emin olmak için PCR reaksiyon sonunda bir erime adım yaparak değerlendirilebilir. Eğer doğruysa, bu eriyik bir adım belirli bir erime zirve oluşturmanız gerekir. Bu noktayı açıklamak için, nanofluidic qPCR verilerin bir alt kümesidir tepe erime t İlgi haritası gösteriliremperature (Şekil 8) 8. , Non-spesifik ürünler 5 yokluğunda sağlamak için, erime sıcaklığı bir PCR ürününün kalitesini değerlendirmek mümkündür . Bu haritada her satır, 43 ayrı qPCR testlerinin (A1-A43) test bir hücre örneği (S1-S40) temsil eder. Bu şekilde, bazı deneyleri oldukça değişkendir ve muhtemelen daha az, yüksek PCR özgüllük ile daha kararlı testleri daha güvenilir olduğu açıktır. Şekil 1 genel bakış, tek bir hücre izolasyonu ve gen ekspresyon analizi . Bu prosedür, fare kalp cerrahi olarak çıkarılması ve bireysel kardiyomiyositlerde izolasyonu gösterecektir. Bu yordamı tartışılan yöntemlerinin tüm transcriptome amplifikasyon (WTA) sonra qPCR veya mikroarray analizi için yöntemler içerir. WTA prosedürü sonra Sigma'nın evrensel primerler bağlayıcı (B) mRNA lizis (A) ile başlarhavuzu. Bu primerler (C) ve amplifikasyon (D) faz uzantısı amplifiye malzeme mikrogram oluşturun. Bu amplifikasyon sonra (E) mikroarray prosedürü için yeterli malzeme üretmek için tekrarlanır. Şekil 2 fare kalp kaldırmak için insizyon yerini temsili. (A) göğüs kafesinin yan duvar boyunca kesin, daha sonra göğüs kafesinin alt marjı (B) birlikte kesti. Hala yeterli aort kalp cannulate bırakarak kalbin üstünde ve altında damarlar Kesme kaldırılmasına olanak tanıyın. Görüntüler MJ Cook 6 uyarlanmıştır. Şekil 3 fare toraks diyagramı. Noktalı çizgiler h zarar vermeden kalp göğüs boşluğu eksize insizyon (A) yerleri gösterir eart doku. Görüntüler MJ Cook 6 uyarlanmıştır. Şekil 4. arkus aorta ve dalları Resim. Gri çizgi aorta (A) Döşeme nerede ideal bir yer olduğunu gösterir. Kanül (B) ucu aort içinde uygun seviyeye (C) gider böylece kalp takılı kalan aort kanüle edilmiştir. Görüntüler F. Gaillard 7 uyarlanmıştır. Şekil 5 gen ekspresyon analizi için tek bir hücre seçimi. Her panel, ışık mikroskobu altında kardiyomiyositlerde tipik morfoloji gösteren görüntülü kardiyomiyositlerde gösterir. Sağlıklı kardiyomiyositlerde yeşil oklarla gösterilir. Ölü ya da ölmek üzere olan hücreler kırmızı oklarla gösterilmiştir. Bu ölü hücreler, analizde kullanılan olmamalıdır. iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" Şekil 6 "/> Şekil 6. Kalite kontrolü WTA sonuçları tek bir hücre amplifikasyonu için. (A) NanoDrop spektrofotometre okuma WTA tepki amplifiye transkript için uygun bir Resim. (B) BioAnalyzer çip okuma üç amplifiye hücreler elde edilen sonuçları göstermektedir. Şekil 7 qPCR amplifikasyon eğrileri (Sol grafik) ve pik sıcaklık eğrileri (sağ grafik) eritebilir. (A) kaliteli bir testte ifade sonuçlar farklı amplifikasyon eğrileri rağmen tek bir erime zirve ile gösterilir. (B), son derece değişken ekspresyon analizi için ideal değildir erime zirveleri olan fakir bir astar seti, eğriler eritin. Şekil 8 tek hücre qPCR tepki için kalite kontrol sonuçlarıiyonları. Bu ısı haritası, bir renk skalası olarak erime sıcaklıkları görüntülemek için oluşturuldu. Her qPCR tahlil için pik erime sıcaklığı (A1-A43) 40, tek tek hücrelerin (S1-40) gösterilir. Testleri onların erime sıcaklığına göre kümelenmiş. Her bir deney için sütun aşağı bakarak, varyasyon örnekleri arasında eriyip görmek mümkündür. Bu rakam bazı qPCR testleri, diğerleri son derece değişken ve böylece tek bir hücre analizi için uygun değildir çok özel olduğunu gösteriyor. Tablo S1 mikroarray veri Ek tablo Bu genlerin büyük bir veri kümesi üzerinde tek kardiyomiyositlerde tespit edildiği sağlamlık göre listelenmektedir . Bu gen listesi, genellikle tek bir kardiyomiyositlerde ifade gen bir dizi için algılama hassasiyeti gösterir.