1. Stap 1 – Cardiomyocyte isolatie Bereid de spijsvertering buffer als volgt: 10 x Spijsvertering Buffer (made in ultra-pure H 2 O) Final Conc. g / L g/500 ml 10x oplossing g / L NaCl 130 mM 7.597 3.3 75,97 KCl 5 mM 0.4 0.2 4.0 Pyrodruivenzuur 3 nM 0,33 0.165 3,30 HEPES 25 mM 5,96 2,85 59,6 MgCl 2 0,5 mM 0.101 0,05 1,01 NaH 2PO 4monobasic 0,33 mM 0,04 0,02 0,40 Dextrose 22 mM 3,96 1,98 39,6 pH buffer tot 7,4 met NaOH Met behulp van de 10x Digestion Buffer, de volgende vier oplossingen voor elk hart dat zal worden geperfundeerd (made in ultra-pure H 2 O): Spijsvertering Buffer A (Maak drie monsters van deze oplossingen) 50 ml – 1x Vertering Buffer met daarin: 75 pi – EGTA-oplossing (100 mM EGTA) Spijsvertering Buffer B (Maak een van deze) 25 ml – 1x Vertering Buffer met daarin: 1.25 il – CaCl 2-oplossing (1 M) 1 mg – Protease 25 mg – Collagenase (can ook gebruik maken van 75% van dit bedrag = 18,75 mg) ** Collectie Buffer (Maak een van deze) 2,5 ml – 1x Vertering Buffer met daarin: 1.25 il – CaCl 2-oplossing (1 M) 0,5 mg – Protease 15 mg – Collagenase (75% = 11,25 mg) ** 125 mg – BSA Neutralisatie Wash Buffer (Maak een van deze) 25 ml – 1x Vertering Buffer met daarin: 6.25 il – CaCl 2-oplossing (1 M) 250 mg BSA ** Afhankelijk van de bron en de partij van collagenase, kan de enzymactiviteit variëren. Het kan nodig zijn om de hoeveelheid enzym toegevoegd aan deze buffer tot ruim-vergisting te voorkomen dat te optimaliseren. Stel het isolatiesysteem zoals eerder beschreven in detail 1,2 met drie 15 ml bekers van Spijsvertering Buffer A op ijs, een 50 ml tube Spijsvertering Buffer A en de 25 ml Digestion buffer B klaar voor perfusie (spijsvertering Buffer A moet gespoeld worden via de lijn, op minimum van 5 ml lopen door het systeem), Collection Buffer opgewarmd in een waterbad om de temperatuur te verhogen tot 37 ° C, en de neutralisatie Wash Buffer bij RT. Vul de perfusie canule en de dissectie gerecht waar het hart zal worden gereinigd en vastgebonden op de perfusie tip losjes met koud spijsvertering buffer A. knoop enkele hechting (4-O om 6-O-formaat) rond het bovenste gedeelte van de canule. Dit zal later worden gebruikt om de aorta te houden naar het hart afglijdt de canule te voorkomen. Terminaal rustig de muis met een IP-injectie van anestheticum (0,25 mL natriumpentobarbital oplossing) en zorgen voor de muis is bewusteloos en reageert op pijnprikkels. Snijd voorzichtig openen van de borstholte aan de thoracale marge met het snijden van de membraan(Figuur 2). Naar boven superieur snijden en de voorste ribbenkast (deze insnijdingen zijn aangewezen B en A, respectievelijk in Figuur 2) reflecteren Kritisch -. De muis moet nog worden voordat ademhaling deze insnijdingen. Met behulp van een plastic pipet op maat gesneden, zachtjes zuigen het hart in de pipet. Snijd het hart uit de borstholte voorzichtig om genoeg van de aorta te verlaten op het hart om duidelijk de aorta tak (figuur 3). Een pipet wordt gebruikt omdat het veroorzaakt minimale schade aan het hart. Drop het hart in een beker met ijs koude Spijsvertering Buffer A en weg te spoelen het bloed. Na 15 – 45 sec plaats het hart in de tweede beker van ijs koude spijsvertering Buffer A in het kort weer te spoelen. Overdracht van het hart in de petrischaal ook gevuld met koude spijsvertering buffer A. Bekijk het hart in de schotel van de spijsvertering Buffer A onder de dissectie omvang en zorgvuldig te isoleren van de aorta en zijn vertakkingen. Zorgvuldig te trimmen gewoon inferieur aan de laatste branch (Figuur 4). Plaats de canule tip in de aorta en ligeren in plaats met de 4-O om 6-O hechting met behulp van het podium setup onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat de canule niet te laag gaan zitten in de aorta en blijft boven de kransslagaders (figuur 4). Met Spijsvertering Buffer A die door de perfusie setup, plaats de perfusie tip over om de setup, en beginnen aan het hart perfuseren totdat het grootste deel van het bloed wordt gewassen uit het hart en vocht het verlaten van het hart is duidelijk. Kritisch – de temperatuur van de perfusie vloeistof moet zo dicht mogelijk tot 37 ° C als het gaat uit van de katheter. Als de oplossing is te warm of te koud is dan is de doorbloeding zal doden het weefsel. De tijd tot de doorbloeding van het hart is ook kritisch. Het tijdvenster moet minder dan 5-10 minuten vanaf wegnemen van het hart tot perfusie begint. Het hart moet worden verwijderd onder narcose, geen CO 2 aanbrengen of cervicale dislocatie. Zodra het bloed is washed uit het hart, naar de destructie-buffer B van de destructie-buffer A. Zorg ervoor dat de destructie-Buffer B nu stroomt door het hart. De oplossing begint met een gele tint hebben. Wacht 2-3 min tot het hart tekenen van het verliezen van zijn vorm en op zoek gaat naar ronde dat is een indicatie dat de spijsvertering werkt. Het myocard moet lichter verschijnen als de perfusie opbrengst. Snijd de ventrikels af met een schaar en plaats in een 50 ml conische buis met 15 ml van de collectie buffer bij 37 ° C. Voorzichtig snijden van de hartkamer in kleine stukjes, terwijl het plaatsen van het weefsel in de collectie Buffer. Meng voorzichtig met een plastic pipet naar de cel-cel adhesie los op en vul een enkele cel cardiomyocyt mengsel. Wanneer de meeste van het weefsel is opgelost, (minder dan 1 min) laat de grotere stukken weefsel zinken naar de bodem. Verwijderen en sla het supernatant om een 15 ml conische buis. Laat de zwaartekracht een pellet te trekken van het supernatant over 10 tot 20 min (15min bij voorkeur) bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant. Was pellet door het toevoegen van 5 ml van de neutralisatie Wash Buffer naar de pellet en meng de cellen om ze te mengen. Op dit moment worden de cellen direct klaar om te worden geselecteerd voor single cell analyse (ga naar stap 2). 2. Stap 2 – Isolatie van individuele cellen Bereid een micromanipulator met behulp van een vlam en een glazen capillaire buis die zal worden gebruikt om cellen te manipuleren. De micromanipulator is gewoon een heel fijn capillair, die vervolgens wordt aangesloten op een lang stuk flexibele slang die kunnen verplaatsen of pick-up-cellen wanneer afzuiging wordt toegepast. Onmiddellijk overgaan tot de selectie van de individuele cellen onder een microscoop (Nikon Eclipse TS100, 20x) met behulp van een micromanipulator dat is opgericht met een getrokken pipet en een luchtsluis om materiaal te voorkomen worden overgebracht naar de cel monsters monster. Zorg ervoor dat de cel populatie gezond is(70% levensvatbare) en niet beschadigd door de isolatie proces. Verdun de cellen die in een kleine petrischaal, zodat ze kunnen afzonderlijk worden geselecteerd. Bij het uitkiezen cellen moet u de cellen vast te leggen in een klein volume (minder dan 2 pi). Selecteer alleen gezonde cellen dat het onderscheidend normale cardiomyocyt morfologie (figuur 5). Plaats individuele cellen in de bodem van de individuele PCR-buizen en onmiddellijk te bevriezen ze op droog ijs. Deze cellen worden vervolgens opgeslagen bij -80 ° C tot ze worden gebruikt voor de analyse van genexpressie. 3. Stap 3A – Single cell qPCR genexpressie Voor het uitvoeren van qPCR op enkele cellen maken gebruik van een protocol overgenomen uit een ontwikkeld voor enkele cel genexpressie door Fluidigm Corporation voor hun biomarkers nanofluidic qPCR arrays (Fluidigm – Advance Development Protocol # 30) 3,4. De voorbereiding van de reverse transcriptie – Specifieke Target Amplification (RT-STA). Te wordengin, hersuspenderen alle primerparen (we hebben gebruikt tot 125 primer paren met succes) voor de genen van de belangstelling op 100 uM in 1x DNA suspensie buffer (10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Combineer en verder van de forward en reverse primer paren te verdunnen tot 20 uM voor elke assay. Ten slotte, verdunnen alle primerparen in een oplossing met een concentratie van 200 nM voor elke test die zal worden versterkt in de RT-STA reactie. Om dit te doen, neem elk primerpaar en verdun ze 1:100. Bijvoorbeeld, als u 30 assay primerparen bij 20 uM, moet u een pi van elk paar (30 pi totaal) toe te voegen, en vervolgens de rest van het volume met 70 pi van DNA suspensie buffer om de finale te bereiken verdunning volume van 100 ul. Nu de primer oplossingen worden bereid, monteren van de RT-STA reactie master mix. Bereid voldoende Master Mix voor elk van de individuele cellen die u wenst te versterken. Reagens Volume in pi (per reactie) CellsDirect 2x Reactie mix 5.0 SuperScript III RT Plantinum Taq mix 0.2 RT-STA Primer mix (200 nM elk assay) 2.5 Nuclease Gratis H 2 O (of 1x DNA suspensie buffer) 1.3 Totaal 9.0 Tabel 1. RT-STA master mix Verwijder onmiddellijk bevroren cellen en centrifugeer bij maximale RCF gedurende 30 seconden om ervoor te zorgen dat de cellen bevinden zich op de bodem van de buis. Voeg 9 ul van RT-STA mix aan de buis en ga naar de reactie in een thermocycler. 50 ° C – 15 minuten 95 ° C – 2 minuten 18 cycli van 95 ° C gedurende 15 seconden 60° C gedurende 4 minuten Houd bij 4 ° C Haal de buizen van de PCR-machine en voeg 4 pi van ExoSAP-IT voor de reactie. ExoSAP-IT is een PCR schoonmaakbeurt reagens dat overtollige primers en enzym zal verwijderen uit de RT-STA reactie. Voer de buizen via de volgende reactie in een PCR-machine. 37 ° C – 15 minuten 80 ° C – 15 minuten Houd bij 4 ° C Wanneer de ExoSAP-IT de behandeling klaar is, verdunnen de monsters 1:05 met DNA suspensie buffer. De monsters worden nu voorbereid om qPCR analyse. Wij gebruiken dit materiaal in combinatie met Gene Fluidigm's uitdrukking qPCR Arrays (48.48, 96.96 of platen). Het is ook mogelijk om deze benadering te gebruiken met meer traditionele qPCR instrumentatie (96 goed of goed 384 formaten). Echter, deze instrumenten vergen doorgaans veel meer monster-ingang waardoor het aantal testen dat kan worden beperkt performed van een enkele cel. 3. Stap 3B – Hele transcriptoom versterking en microarray van enkele cellen Extractie en Versterking Gebruik Sigma's WTA2 kit (Cat # WTA2) tot dubbel-strengs cDNA van zowel pellets en enkele cellen te versterken. Enkele cellen worden "uitgepakt" via de eerste stap van Sigma's WTA2 protocol volgens de instructies van de fabrikant. Tijdens deze eerste stap de incubatie met bibliotheek synthese buffer bij 37 ° C gedurende 5 minuten verstoort het membraan van de afzonderlijke cellen en "extracten" de boodschap voor de versterking. Amplify enkele cellen in twee rondes, met behulp van de aanwijzingen van WTA2 kit de Sigma-Aldrich's. Voer de bibliotheek prep stap volgens protocol van de fabrikant; dan 1 / 5 van de bibliotheek monster toe te voegen aan 70 pi van de WTA2 versterking Master Mix. Amplify de monsters voor 25 cycli met de aanbevolen fiets-parameters. Zuiver de monsters using Qiagen's QIAquick PCR Purification Kit (Cat # 28104) en proces op Qiacube Qiagen's met behulp van de "Cleanup QIAquick PCR amplificatiereacties Standard V4" protocol. Concentreer de gezuiverde monsters naar 5 uL, met behulp van een vacuüm snelheid, en door een tweede ronde van versterking voor 17 cycli (WTA2 versterking protocol en fietsen parameters herhaald). Zuiver monsters met behulp van de PCR Purification Kit QIAquick en controleert de kwaliteit met behulp van een spectrofotometer NanoDrop en Agilent's BioAnalyzer DNA-7500 kit volgens protocol fabrikant. Etikettering en NimbleGen Gene Expression Arrays Label 2 ug van dubbelstrengs cDNA van elk geamplificeerd cel monster met behulp van NimbleGen's One Color Labeling Kit (Cat # 05223555001) volgens protocol van de fabrikant. Hybridiseren 5 ug van Cy3 gelabeld monster op Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Arrays (Cat # 05543797001) conformOrding het protocol van de fabrikant. Na hybridisatie van de monsters naar het arrays, moeten de dia's dan worden gewassen en gedroogd voordat ze kunnen worden afgebeeld op een laser scanner. Scan Gene Expression Arrays met behulp van een laser scanner. Hier gebruiken we een Molecular Devices GenePix 4200A Scanner met de instellingen van 100POW, en 300-350PMT. Vervolgens genereert het paar bestanden voor elke array met NimbleScan software NimbleGen en vervolgens voor het hele transcriptoom expressie te analyseren vanuit elke afzonderlijke cel array (een tabel van de typische stabiel tot expressie cardiomyocyte transcripties is opgenomen als een supplement, tabel S1). Als het hart perfusie werkte goed er moet een hoog percentage gezond hart cellen die hun typische rechthoekige morfologie behouden op isolatie worden. Als de doorbloeding niet goed verloopt dan zal er een groot percentage van de dode cellen (zie afbeeldingen in figuur 5) zijn. Als de cellen juist versterkt met behulp van de WTA2 of RT-STA methoden den de eindproducten moet passeren de daaropvolgende kwaliteitscontroles voor de kwaliteit van mRNA monsters door NanoDrop en BioAnalyser (figuur 6). Voor de microarray workflow, wordt deze voltooid na WTA versterking waarbij het mRNA wordt getest door zowel NanoDrop en Bioanalyzer. Vertegenwoordiger van positieve resultaten voor deze analyse zijn weergegeven in figuur 6. De WTA2 monsters moet blijken een robuuste versterking van zowel de NanoDrop spectrofotometer te lezen, evenals de electropherogram uitlezen van de Bioanalyzer (BA) chip (Figuur 6). Een tabel van de genen die stabiel werden ontdekt via microarray van enkele cellen is opgenomen als een voorbeeld (tabel S1). Voor de qPCR proces, kan de kwaliteit van de gegevens worden beoordeeld door het uitvoeren van een smelt stap aan het einde van de PCR-reactie om ervoor te zorgen dat de primer sets het gewenste product (figuur 7) versterken. Indien correct, moet dit smelten stap genereert een specifieke smelten piek. Ter illustratie van dit punt, is een subset van nanofluidic qPCR gegevens weergegeven in een heatmap van de piek smelten temperature (figuur 8) 8. Het is mogelijk om de kwaliteit van een PCR-product door de smelttemperatuur te beoordelen op het ontbreken van niet-specifieke producten 5 te garanderen. Elke rij van deze kaart vertegenwoordigt een cel monster (S1-S40) getest in 43 afzonderlijke qPCR assays (A1-A43). In deze figuur is het duidelijk dat sommige assays zijn nogal variabel en zijn waarschijnlijk minder betrouwbaar dan de meer stabiele testen met een hogere PCR specificiteit. Figuur 1. Overzicht van de enkele cel isolatie en genexpressie analyse. De procedure zal tonen de chirurgische verwijdering van de muis het hart en de isolatie van de individuele hartspiercellen. De methoden besproken in deze procedure zijn de methoden voor zowel qPCR of microarray analyse na volledige transcriptoom amplificatie (WTA). De WTA-procedure begint met het lysis (A), dan de binding van Sigma's universele primers (B) op de mRNAzwembad. De uitbreiding van deze primers (C) en de versterking (D) fase maken microgram versterkt materiaal. Deze versterking wordt vervolgens herhaald (E) om voldoende materiaal voor de microarray procedure te genereren. Figuur 2. Vertegenwoordiging van de locatie van de incisies om het hart te verwijderen van de muis. Snijd langs de laterale wand van de ribbenkast (A) en snijd langs de onderste rand van de ribbenkast (B). Het snijden van de schepen boven en onder het hart zorgen voor het verwijderen en toch laat genoeg van de aorta naar het hart canule. Afbeeldingen aangepast van MJ Cook 6. Figuur 3. Schematische voorstelling van de thorax van de muis. De gestippelde lijnen geven de locaties van de incisies (A) voor weg te snijden het hart van de borstholte, zonder beschadiging van de h eart weefsel. Afbeeldingen aangepast van MJ Cook 6. Figuur 4. Afbeelding van de aortaboog en haar takken. De grijze lijn geeft de ideale locatie van waar de aorta (A) trim. De resterende aorta bevestigd aan het hart is canule, zodat het uiteinde van de canule (B) gaat naar het juiste niveau binnen de aorta (C). Afbeeldingen aangepast van F. Gaillard 7. Figuur 5. Selectie van enkele cellen voor genexpressie analyse. Elk paneel toont cardiomyocyten afgebeeld onder de lichtmicroscoop met typische morfologie van de hartspiercellen. Gezonde cardiomyocyten zijn aangegeven met de groene pijlen. Cellen die dood of stervend worden weergegeven met rode pijlen. Deze dode cellen mogen niet worden gebruikt in de analyse. iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" Afbeelding 6 "/> Figuur 6. Kwaliteitscontrole WTA resultaten voor de enkele cel versterking. (A) Afbeelding van een spectrofotometer NanoDrop uitlezing die geschikt is voor de versterkte transcripties van de WTA reactie. (B) Het uitlezen van de chip BioAnalyzer toont de resultaten van drie versterkt cellen. Figuur 7. QPCR versterking bochten (links grafiek) en piek smelttemperatuur curves (rechts grafiek). (A) De uitdrukking het gevolg is van een kwaliteit assay worden weergegeven met een enkele smelt piek ondanks verschillende versterking curves. (B) Smelt curves voor een slechte primer set, die zeer variabel smelten pieken die niet ideaal is voor expressie analyse. Figuur 8. Kwaliteitscontrole resultaten voor de enkele cel qPCR reagerenionen. Deze warmte kaart is gemaakt om de smelt temperaturen als een kleurenschaal weer te geven. De piek smelttemperatuur voor elke qPCR assay (A1-A43) is getoond voor 40 individuele cellen (S1-40). De testen werden gegroepeerd volgens hun smelttemperatuur. Door te kijken naar de kolom voor elke assay is het mogelijk om de variatie te zien smelten in alle monsters. Dit cijfer toont aan dat sommige qPCR assays zijn zeer specifiek terwijl anderen zijn zeer variabel en zijn dus niet geschikt voor single cell analyse. Tabel S1. Aanvullende tabel van microarray data. Deze genen worden opgesomd volgens de robuustheid waarin ze zijn aangetroffen in enkele cardiomyocyten over een groot dataset. Dit gen lijst geeft de gevoeligheid van de detectie van een aantal genen die normaal gesproken worden uitgedrukt in een cardiomyocyten.