וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

הבחירה של אורך גל לייזר, מראה dichroic, ומסננים אופטיים צריך להיקבע על בסיס צבעים הספציפי שבשימוש בניסוי. לדוגמה, הדמיה confocal מדגם מוכתם אלקסה 488 פלואוריד מושגת הטובה ביותר באמצעות לייזר 488 ננומטר, 500 ננומטר ארוך לעבור המראה dichroic, ו 30 ננומטר רוחב פס bandpass במראה מרוכז ב 515 ננומטר. לעומת זאת, הדמיה confocal של צבע אדום אלקסה פלואוריד 647 ידרוש קבוצה שונה של מרכיבים. המיקרוסקופ בפרוטוקול זה נבנה לדמיין כל צבע הקולט חזקה ב 400 ננומטר ופולט מעבר 450 ננומטר. לכן אנו בוחרים לייזר עירור 406 ננומטר ננומטר 425 ארוך לעבור dichroic כדי לשקף את קרן הלייזר. Fluorophores מתרגש שניתן לדמיין באופן סלקטיבי על ידי בחירת מסנני פליטה מתאימים. חשוב השימוש הנכון הרכבה חומרה אופטיים ברחבי בפרוטוקול צוין, חומרה פסולים או מאולתרים לא תקיים יישור גם יכול להיות מפגע בטיחותי. <p class = "jove_title"> 1. הגדרת את המראה galvanometric התהודה אופטיקה ממסר מושג חשוב בבניית כל סוג של מערכת סריקה confocal הוא telecentricity. במערכת אופטית telecentric, עדשות מרווחים אחד מהשני על ידי בסכום של אורכי מוקד שלהם, כך הגדלה של המערכת מוגדרת רק על ידי היחס של אורכי מוקד 1. דבר זה מאפשר בנייה של מערכת ממסר אופטי שבו בהגדלה, וכך את מאפייני המערכת, מוגדרים בקלות על ידי בחירה של עדשות. מושג חשוב נוסף כרוך שנקרא "נייח" המטוסים אופטי, המכונה גם "המטוסים צוהר". מטוס הצמצם היא עמדה בנתיב אופטי שבו קרן אור לא לעבור כל סוג של תנועה לרוחב. בעיצוב זה מיקרוסקופ, ישנם שלושה מטוסים צוהר חשוב: מראות סריקה הראשון והשני, ועל גב הצמצם של העדשה אובייקטיבי. על מנת להשיג אופטימלי קרן SCAnning על המטוס מוקד של המטרה, קרן הכניסה את הצמצם האחורי של העדשה אובייקטיבי חייב להיות נייח, גורף רק זווית. על מנת ליצור נייח, זווית נסחף מטוס, אנחנו צריכים להציב את מראות סריקה הראשון והשני בבית המצומד, מטוסים telecentric למטרה גב הצמצם. עדשות ממוקם בין מראות את העדשה מטרה לשרת להעביר את קרן זווית סרק בין מטוסים נייח (איור 2). המראות סריקה הם רכובים על שני galvos סריקה, שכל אחד מהם אחראי על סריקת בכיוון נתון של המטוס דימות (X ו-Y). כדי להשיג את קו נדרש לסרוק שיעור הדמיה וידאו שער, galvo גבוהה תדר התהודה הנדרש כדי לסרוק את ציר x (הידוע גם בשם ציר "מהיר"). Galvos אלה לנצל רגיש, לולאה סגורה מעגלי משוב ליצור דפוס סריקה סינוסי ומסוגלים הפועלים בתדרים גבוהים מאוד, בחרנו galvo 8 kHz עבור זה לבנות. להקיםcollimator סיבים אופטיים בהר בערך לכוון את אלומת האור באמצעות ברגים התאמה כזו שהוא נוסע בקו ישר אופקית ואנכית. עכשיו, לקחת איריס ולמקם אותו מול collimator סיבים, התאמת גובה אנכי של אירוס כזה הקורה עובר דרך נקייה במרכז הקשתית. בשלב הבא, להזיז את איריס הרחק collimator לאורך השביל הקורה ולבחון אם הקורה עדיין עובר במרכז הקשתית. אם לא, לשנות את מיקום הקרן על הקשתית באמצעות שני ברגים הסתגלות. מניחים את המראה dichroic רכוב בנתיב קרן עם קרן לייזר ממוקמת במרכז כ המראה. לפני מהדק את המראה לשולחן, לסובב את בעל מראה על מנת לשקף את הקורה על כ 90 מעלות בערך להתאים את ההשתקפות כך גובה אנכי של קרן הלייזר משתקפת לא משנה. מראה מקום רכוב galvanometric מהדהד לתוך נתיב קרן הלייזר, לוקחים מכוניתהדואר כדי להבטיח את קרן הלייזר ממוקם במרכז אופקי המדויק של פני השטח את המראה. בפרוטוקול זה, המראה היה מהדהד galvo expoxied ישירות הר מראה. סובב הר במראה כדי לשקף את קרן הלייזר בזווית של 90 מעלות. בערך להתאים את השתקפות את המראה כדי לשמור על אותה קרן לייזר גובה אנכי. על מנת לכוון כל קרן אור בכיוון מסוים, יש בהגדרה להגדיר שתי נקודות בחלל שדרכו קרן תטייל. מטרה זו מושגת בדרך כלל על ידי הצבת שני אירוסים לאורך השביל האופקי והאנכי הרצויים מניפולציה של קרן הלייזר לעבור במרכז הקשתית כל אחד. ארבע דרגות חופש נדרשים להתאים את הקורה, שתי מעלות אופקי ואנכי של חופש עבור כל אירוס. הדרך הנפוצה ביותר וישיר כדי להשיג את דרגות החופש הוא להשתמש בשתי מראות לנווט, או "ללכת", קרן לייזר. קח שני אירוסים, ולהגדיר גובה אנכי שלהםבשלב 1.1, באמצעות קרן לייזר לידי ביטוי את המראה התהודה galvo כנקודת התייחסות. כעת, באמצעות חורי הברגים על קרש החיתוך אופטי כמדריך העין, מהדק את שתי קשתיות למטה בקו ישר. התאם את המראה dichroic ואת המראה galvo התהודה לכוון את קרן הלייזר דרך מרכז של שני אירוסים. השתמש במראה הראשון בדרך (המראה dichroic) למרכז הקורה על אירוס הראשון, ולאחר מכן השתמש במראה השני בדרך (את המראה התהודה galvo) אל הקורה במרכז הקשתית על השני. Iteratively להתאים אלה שתי מראות עד הקורה מיושרת דרך אירוסים שני, להבטיח כי בכל קרן הלייזר משתקפת מהמראה galvo התהודה משתקף עדיין ממרכז המראה משוער. אם הקרן חרג, להתאים את הר collimator סיבים איטרטיבי לחזור על השלבים שלעיל. עם הקורה התרכזו אירוסים שני, אנחנו עכשיו במקום שתי עדשות ממסר אשר התמונה הראשונה נייח שלנו, תוכנית telecentricדואר (כלומר, את המראה התהודה galvo) על second מטוס שלנו, נייח telecentric (כלומר, מהירות תקן galvo המראה). עבור מיקרוסקופ מיוחד זה, עדשות נבחרים ממסר הראשון יש את אותו אורך מוקד, "F", כך המרחק בין שתי מראות במערכת telecentric שלנו הוא פשוט 4f. כדי להבטיח את העדשות מרוכזים בדיוק בנתיב קרן, השתמש טריק יישור העדשה. מניחים את העדשה הראשונה נתיב קרן ולהסתכל במקום קרן לייזר על הקשתית הבא בנתיב קרן הבאים העדשה. לאחר מכן, להתאים את גובה העדשה במאונך כך במרכז האנכי של הקורה הוא במרכז הקשתית. לבסוף, להתאים את המיקום הקורה אופקית על הקורה במרכז הקשתית. ביצוע הליך זה זהה עבור העדשה השנייה. 2. הגדרת את המראה סריקה שנייה סיבוב מיקרוסקופ כדי למצוא את המיקום המדויק של המטוס telecentric השני, לחבר את galvo התהודהיחידת הסריקה שלה להפעיל אותו. השתמש כרטיס ביקור לבן כדי לעקוב אחר הקורה סריקה דרך שתי עדשות. תוכלו למצוא את המטוס telecentric במרחק משוער של 4f מן galvo תהודה, שבו קרן הלייזר יופיעו נייח לחלוטין. מרק עמדה על קרש החיתוך. מקם את המראה סריקה סטנדרטית galvo במיקום המדויק מטוס זה telecentric, ולהתאים את גובה המראה והמיקום כזה הקורה בבית המטוס telecentric שביתות המרכז המדויק של המראה סריקה. זה חיוני לשלטון את החומרה לשלוט במראה ולשים מתח של 0 וולט על קלט את המראה סריקה כך במראה ישקע למצב נייטרלי שלה במהלך תהליך זה. בזהירות לכוון את זווית המראה לכוון את אלומת אנכית, להדק בעדינות את המראה בעמדה. כאשר אנו בונים מיקרוסקופ זקוף, אנחנו עכשיו לצרף את קרש החיתוך שנייה בזווית של 90 מעלות בעזרת 90 מעלות בסוגריים גובר. הקפד לכבותלייזר ואלקטרוניקה סריקה, לנתק את סיב, ונתק את מראות סריקה במהלך תהליך זה. כדי להפוך את שאר יישור קל, לאחר בסוגריים מוברג למקום, בזהירות לסובב את מיקרוסקופ כל כך קרש החיתוך החדש הוא עכשיו שוכב. השתמש מהדק לתקן את קרש החיתוך על משטח העבודה. עכשיו שאר ההתקנה האנכי לשעבר יכול להתבצע בקלות על קרש החיתוך שטוח. 3. הגדרת את הסריקה, שפופרת, ועדשות אובייקטיבי הבא אנו להגדיר את הסט השני של עדשות ממסר, המכונה רשמית בשם "העדשה לסרוק" ו "העדשה צינור". חשוב לבחור את השילוב הנכון של עדשות כדי להשיג את ההגדלה הנכונה במוקד מטרה לייעל את רזולוציית התמונה הסופית. ראשית, כדי להשיג את מספרי הצמצם המקסימלי (NA) של העדשה כל נתון אובייקטיבי, את קרן הלייזר בולט האחורי של המטרה חייבת למלא אתבחזרה הצמצם לחלוטין, ורק אז את העדשה אובייקטיבי יוכלו ליצור מוקד ההדוקה. עדשות המטרה יש מגוון של גדלים הצמצם חזרה, בחרה יחס הגדלה העדשה מעט תמלא יותר מדי את הצמצם האחורי של המטרה שנבחרה. שנית, על מנת להשיג את ההגדלה נכון, העדשה המטרה חייבת להיות בהתאמה עם אורך מוקד העדשה צינור שלשמה נועד. למרבה הצער, המטרה יצרנים שונים מיקרוסקופ בחרו להשתמש שונים העדשה צינור אורכי מוקד, ולכן חשוב לבנות מיקרוסקופ עם עדשה הצינור הנכון עבור העדשה מטרה ספציפית מועסק. יתר על כן, יצרניות מסוימות, כגון Zeiss, עיצוב עדשות הצינור שלהם כדי לפצות על סטיות כרומטית ספציפי של מטרה מתאימים שלהם, כך באמצעות זוג ראוי אובייקטיבי שפופרת העדשה יהיה למעשה להציג סטיות חדשים שאחרת לא להיות נוכח. בדרך כלל אנו מעדיפים יעדים אולימפוס, כמו כל פיצוי כרומטית מתבצע ההמטרה הדואר עצמו, מה שהופך את העדשה אובייקטיבי / צינור הזיווג קלה יותר. למרות המיקרוסקופ ימשיך לעבוד אם המטרה ואת העדשה הצינור אינם תואמים, ההגדלה במיקרוסקופ בפועל סביר להניח כי לא להתאים את ההגדלה רשום על העדשה אובייקטיבי. בשביל זה מיקרוסקופ לבנות בפרט, גודל הצמצם האופטימלי בחזרה היה נחוש בדעתו להיות 4 מ"מ, הדורש יחס ההגדלה 01:04 בין העדשה לסרוק העדשה צינור. בשביל זה מיקרוסקופ אישית לבנות, נשתמש אורך העדשה סריקה של 75 מ"מ ו עדשה צינור באורך של 300 מ"מ. ככל שהמרחק הכולל בין המראה את הסריקה השנייה להתמקד המטרה היא גדולה, זה קטע של המיקרוסקופ לבנות הפריסה הראשונה תהיה המראות צורך לכוון את אלומת האור אל העדשה אובייקטיבי. המקום הראשון גדול, 2 "(50 מ"מ) מראה בקוטר קרוב לקצה קרש החיתוך, לסובב את הר מראה על מנת לשקף את קרן הלייזר כ 90 מעלות. בערך להתאים את השתקפות את המראה כדי לשמור על ביה אנכי אותומ 'גובה. המקום השני 2 "מראה בקצה השני של קרש החיתוך על אוריינטציה שמנתב את אלומת האור כלפי מטה בזווית של 90 מעלות. השתמש בברגים כדי להבטיח התאמה לגובה אנכי של הקורה אינו משתנה. להגדיר שני אירוסים, כמו בשלב 1.4, ולהתאים את שתי מראות כמצוין בשלב 1.5 למרכז הקורה על האירוסים. עם אירוסים עדיין במקום, במקום לסרוק את העדשה בנתיב קרן ולהתאים את המיקום האופקי והאנכי למרכז כתם הלייזר על הקשתית הראשונה. באותו מרחק של 75 מ"מ + 300 מ"מ מן העדשה (בין שתי מראות), בזהירות למקום גדול 2 "עדשה צינור ולהתאים את המיקום האופקי והאנכי למרכז הקורה על הקשתית הראשונה. לצורך שמירה על יישור בעתיד, כדאי להשאיר את האירוסים במקום, עבור יישום זה, כרטיס ביקור עם חור בגודל מתאים יכול להיות דבוק לעמוד ונוסף בנתיב הקורה. עם כל מראות ועדשותעכשיו במקום, להתחיל לסרוק את המראה התהודה galvo והמראה סריקה סטנדרטית. בחודש זה לבנות, במראה סריקה רגילה בסופו של דבר להיות מסונכרנות לקצב סריקה של המראה מהדהד דרך המעגל שהותקן שליטה, כגון זה המתואר באיור 3, זה מספק סנכרון אנכי ואופקי מעולה. עם זאת, לצורך יישור יישומי הדמיה רבים, המראה יכול בקלות להיות סרוקים באמצעות דפוס המשוננת של גנרטור פונקציה. באמצעות כרטיס ביקור, אתר את קרן הלייזר לעבר עמדה 300 מ"מ אחרי העדשה צינור. למרות הקורה היא סריקה במקום אחר המיקרוסקופ הן כיוונים אנכיים ואופקיים, קרן אמור להיות נייח לחלוטין ליד במיקום זה. זה המקום שבו את הצמצם האחורי של העדשה אובייקטיבי יוצב. אם המטוסים נייח אופקי ואנכי אינם חופפים בכל מטוס אותו לאורך השביל קרן, בזהירות unclamp ולתרגם את העדשה צינור לאורך השביל אופטי על מנת להבטיח כישני מטוסים חפיפה ככל האפשר. Re-מרכז את המיקום אנכי ואופקי של העדשה צינור מהדק אותו היטב במצב. מניחים את העדשה אובייקטיבי בנתיב קרן, מוודא למצב העדשה המטרה בחזרה הצמצם קרוב למישור יציב ככל האפשר. הצמצם האמיתי בחזרה אובייקטיבי לא יכול בעצם להיות ממוקם תמיד בפתיחת בחזרה הפיזית של המטרה בשל אפשרויות עיצוב שונות היצרן. לכן תמיד עדיף לבדוק עם היצרן כדי לקבוע את המיקום האמיתי הצמצם בחזרה. הגדרת את הבמה מדגם, מוודא כי הר תרגום שיאפשר תנועה Z-ציר יכול לנוע על פני טווח מלא שלה מבלי להיתקל בהר העדשה אובייקטיבי. 4. הגדרת והתאמת חריר גלאי confocal ו נתק את כל ספקי כוח סיבים אופטיים, וסובב את הרכבה מיקרוסקופ כך זה שוב נשענת על קרש החיתוך מחזיק את resoראי סריקה nant. קלאמפ ארובה בבטחה במקום, ולאחר מכן להתחבר מחדש סיבים collimator, ואת שניהם לחבר מחדש galvos וכבלים לשליטתם. כמו קודם, במקום 0 וולט מתח על השליטה נהיגה galvo סריקה סטנדרטית. על הבמה המדגם, במקום כרטיס ביקור או נפח קטן של צבע בהיר בפוקוס המטרה, דחוקה בין שתי coverslips. הבחירה לצבוע יהיה תלוי לייזר ו dichroic הנבחר; במקרה הזה נשתמש פליטת הקרינה מן כרטיס ביקור לבן כדי ליישר את מערכת זיהוי confocal. נקודות קוונטיות יכולה להיות שימושית גם לצורך יישור, כפי שהם בהירים לא photobleach. חלופות אחרות כוללות חרוזי ניאון ו / או דוגמאות בד חשוף brightener צבע / כביסה, שניהם לזרוח באור יקרות. הפעל את מקור הלייזר ולהביא את המדגם אל המוקד באמצעות מיקרוסקופ שלב התרגום. פעם להתמקד, את הקרינה שנוצר מן המדגם צריך להיות גלוי מאחורי tהוא מראה dichroic, כפי שמתואר בשלב הבא. מקסם הכוח לייזר על מנת להפוך את הקרינה כמו בהיר ככל האפשר. באמצעות כרטיס ביקור, לעקוב אחר פליטת הקרינה מן המדגם דרך העדשה חזרה אובייקטיבי באמצעות מערכת סריקה במראה dichroic. המראה dichroic תשדר את פליטת הקרינה בזמן המשקף את קרן הלייזר; למצוא את האות הקרינה בצד השני של המראה dichroic. עכשיו, במקום המראה מאחורי הראי dichroic ולהשתמש בו כדי לשקף את פליטת בזווית של 90 מעלות. קח איריס, כפי שנעשה בשלב 1.1, ולהשתמש בו יחד עם המראה לכוון את אלומת הקרינה כמו ישרות ומקבילות אל קרש החיתוך ככל האפשר. שלב זה עשוי להתבצע הטוב ביותר באור עמום. הגדרת יחידת חריר confocal כמתואר באיור 2. מצאנו כי המרחבי לסנן כלוב הר הרכבה של ThorLabs אידיאלית עבור משימה זו. חשוב לבחור pinhol המתאיםגודל הדואר על מנת להבטיח כי מערכת confocal מגיע ברזולוציה אופטימלית שלה בלי להקריב את האות יותר מדי. עבור מיקרוסקופ זה אישית, גודל חריר של 100 מיקרומטר נבחר. הנח את יחידת מסנן מרחבי בקנה אחד עם נתיב קרן הקרינה, מקפיד במרכז הר first עדשה תוך התמקדות הקורה פליטת הקרינה. לאחר הרכבה עדשה אורך מוקד קצר ביחידה (מטרה מיקרוסקופ יכול לשמש גם), החלק את Z-תרגום עד הר מוקד ברור ניתן להבחין על פני השטח חריר. ודא כי היחידה כולה מכוונת לאורך קו ישר המדויק נקבע על ידי אלומת הקרינה. הצמד את המכשיר קרש החיתוך. הפליטה מרוב דגימות חלש לעומת רמות אור הסביבה אפילו בחדרים חשוכים. זה חיוני, אפוא, כי מיגון הולם / אור מביך לשמש לאורך השביל פליטה כדי להגן מפני זיהום אור תועה. יתר על כן, רמות גבוהות של אור הסביבה עומס ונזק PMTs רבים, במיוחד אלה עם ג לא יהיהurrent הגנה. הקוראים ולכן הם הפצירו מאוד להשתמש צינורות עדשה לצרף את קרן נתיב פליטה, מערכת מוגן כראוי, כמו זה הוכיח כאן, הוא מסוגל המבצע לאור חדר עם מעט לזיהום אין אור תועה. כעת, באמצעות ידיות הסתגלות על הבמה בתרגום, באופן שיטתי להעביר את חריר confocal כדי למצוא את הנקודה בה את האות דרך חריר הקרינה היא מרבית. עמדה זו מזוהה בקלות על ידי התאמת איטרטיבי של שני צירים כדי לבצע חיפוש 2D על פני הר חריר. לאחר מיקום האות למקסם נמצא, במקום עדשה collimating בהר כלוב לאחר חריר. מצא את פליטת הקרינה שעוברת דרך יחידת confocal באמצעות כרטיס ביקור, והחלק את העדשה לאורך collimating הודעות עד האות הקרינה הנפלטת היא collimated ככל האפשר. לאחר הקורה collimated, כדי להיות בטוח במקום מסנן מתאים בנתיב קרן באמבטיה עדשהה הגדר את הצינור מכפיל (PMT) הרכבה. מניחים 50 מ"מ אורך מוקד העדשה נתיב פליטת הקרינה הקורה ולמצוא מוקד שלה באמצעות כרטיס ביקור. מרק עמדה על קרש החיתוך. עכשיו, לכבות את הלייזר לחלוטין – זה חשוב, כמו אור לייזר תועה או המתחדדת יכול לגרום לנזק בלתי הפיך ביותר PMTs. מקם את PMT כך האזור הפעיל שלה ממוקם קרוב למוקד מסומנים ככל האפשר. חבר את הרכבה PMT העדשה מתמקדת באמצעות צינורות עדשה מתכווננת, בזהירות לעטוף קלטת כהה סביב כל השבילים קרן חשוף הבאים חריר. הפעל את הלייזר, אך הקפד לשמור על צריכת חשמל נמוכה ביותר שלה כך את פליטת הקרינה היא בקושי נראית לעין. הפעל PMT, בזהירות לקרוא את המתח שלו על אוסצילוסקופ כמו מתח שליטה מוגברת. PMT מייצר אותות דרך סדרה של שלבים הכפלת אלקטרונים, אם פוטוני גבוה מדי עבור רמת לאור האירוע, הצינור יכול להיותPMTs ניזוק באופן בלתי הפיך. המעגלים עם הגבלת זרם ולכן מומלץ מאוד, במיוחד עבור משתמשים שלא עבד עם גלאי כזה לפני כן. הגדלת מתח בקרה PMT עד readout ספייק דמוי ו / או לקזז DC ניתן לראות על המסך אוסצילוסקופ, עבור רוב PMTs, האות הזה יהיה שלילי יחסית לקרקע. ודא אות זו אכן נובעת הקרינה על ידי סיבוב כוח לייזר מעל להתבונן הפסד של האות. לבסוף, iteratively ליישר את חריר עבור האות המרבי על האוסילוסקופ הראשון על ידי מניפולציה של העדשה למקד Z-המיקום, ולאחר מכן להתאים את שלב התרגום YZ. חומרה וידאו שער מיקרוסקופ הושלמה! עכשיו לחבר את המראות, לוחות בקרה מותאם אישית, ואת המחשב ניתח כמו באיור 3. כאמור לעיל, מומלץ להשתמש במערכת הדמיה קודם לדמיין רגיל בגודל הידוע כדי למצוא את הפתרון האופטימלי של המיקרוסקופ ולחשב את הפיקסלל-רזולוציה קבוע עבור מערכת הדמיה. יש סטנדרטים גודל רבים שניתן להשתמש בהם, כגון כרטיסי ביקור לבן עם ידועה בגדלים מכתב, פלואורסצנציה או רעיוני כוח מטרות באוויר, פלורסנט microspheres. 5. הכנת מערכת confocal סריקה microendoscopy בחודש זה לבנות נשתמש בסיבים תמונה קוהרנטית, אשר מורכב צרור של אלפים רבים של גרעינים סיבים; הסדר כזה מאפשר דימוי להיות מועבר באמצעות סיב ושיחזר בקלות ו / או מורחבת בקצה השני (איור 4). צרור הסיבים קוהרנטית המשמשים לבניית אנדוסקופ זה מלוטש בשני קצותיו, מה שהופך אותו מה שנקרא "קשר למצב" microendoscope. תמונה ב-להתמקד ולכן יהיה רק ​​להיווצר כאשר קצה microendoscope מובא בקשר הדוק עם אובייקט. בהסדר פסאודו confocal זה, פעולה הסריקה של מיקרוסקופ מתמקד הלייזר על f oneiber הליבה בכל פעם, בעוד חריר confocal מבטיח כי אין אור מחוץ המוקד מן הסיבים המקיפים מותר לעבור אל הגלאי. עבור יישומי הדמיה שונים, סט של עדשות ניתן להוסיף על קצה דיסטלי כדי לאפשר הדמיה הפונה קדימה למרחקים ארוכים, פלואורסצנטי. עדשות Microoptic, כמו גם השבירה שיפוע מדד (והחיוך) עדשות יכול בקלות להיות מותאם לשימוש זה, והוא יכול להיות מודבקת על קצה דיסטלי סיבים באמצעות דבקים איכות אופטית. כדי להגדיר את מערכת הדמיה עבור microendoscopy, להסיר בזהירות את הבמה מדגם ולהחליף אותו בשלב סיבים מחזיק (איור 5). טובלים קצה אחד של צרור סיבים בתמיסה חלשה של צבע, כך פליטת הקרינה נוצרת באופן שווה על פני כל הליבות סיבים. הפעל את מערכת הסריקה ולהתאים את בעל סיבים כדי להביא את הקצה השני של צרור סיבים (סוף הפרוקסימלי, או סוף הקרוב אופטיקה מיקרוסקופ) בפוקוס. ראשית, השימוש בתרגום התאמה scrEWS למרכז סיבים בתחום סרוקות. עכשיו, להסתכל על התמונה פליטת הקרינה מקצה סיב הפרוקסימלי בזמן הסריקה. כאשר פני השטח microendoscope להשלים הוא במישור המוקד של המטרה, את פליטת הקרינה בכל ליבות סיבים יהיה אחיד ככל האפשר. השתמש ידיות התאמת הזווית כדי להתאים את הפנים סיבים כדי להפוך את כל ליבות סיבים בהיר באופן שווה. במהלך הסתגלות זו, סביר להניח שיהיה צורך להתאים מחדש את עמדת התרגום מחדש במרכז סיבים בתחום סרוקות. לחזר באמצעות התאמות אלה עד קצה סיב כולו נכונה בפוקוס. לפני השימוש microendoscope, לנקות בעדינות את קצה דיסטלי באמצעות ניקוי עדשות הנייר הרטובות מעט עם מתנול HPLC כיתה. כמו קודם, לשימוש רגיל בגודל ידוע למדוד ולחשב את הרזולוציה של מערכת דימות microendoscope. 6. נציג תוצאות: איור 6 מציג דוגמה UPR סייםסריקה ight מיקרוסקופ confocal מוגדר microendoscopy. אלומות לייזר פליטת צוירו כמדריך לעין. הר סיבים סיב מחזיק תמונה במקום במהלך מבצע microendoscopy. הר זה סיבים אפשר להחליף בקלות עם xy או xyz שלב התרגום לשימוש כפלטפורמה מיקרוסקופ זקוף. ThorLabs חלקים PT3 (XYZ תרגום) או שניים מוערמים PT1 שלבים (XY תרגום) עובד היטב עבור יישום זה, יחד עם סוגר בזווית ישרה כמו חלק ThorLabs AP90. כרטיס וידאו שער framegrabber משמש להפקת תמונות האות הנכנס. איור 7 מראה תמונה מבחן נציג של כל מקרה נלקח נמוך "m" מודפס על כרטיס ביקור לבן באמצעות מערכת וידאו שער מיקרוסקופ סורק. נייר לבן מולבן מכיל fluorophores כי נרגשים על ידי אור אולטרה סגול וכחול, וכתוצאה מכך רקע בהיר מאחורי מכתב כהה "m". מסנן פליטה מרוכז ב 515 ננומטר נבחר כדי לאסוף את פליטת ניאון. מ 'inor עיוות של התמונה ניתן לראות, בעיקר ליד הקצוות לרוחב של מסגרת התמונה. תוצאות זה עיוות מהתבנית סריקה סינוסי המראה gavlo 8kHz ו יידונו בפירוט להלן. באיור 1. תרשים הממחיש את עקרון הפעולה של מיקרוסקופ confocal. הקרניים שמקורם להתמקד המטרה מועברים בחזרה דרך מערכת וממוקד דרך חריר confocal (אדום). הקרניים שמקורם לעיל או (כחול) או למטה (ירוק) מוקד המטרה לא לצאת מן המטרה collimated, ולכן לא מועברים באופן יעיל דרך חריר confocal. באיור 2. דיאגרמה המציגה את כל נתיבי האור באמצעות מערכת סריקה הקורה. מראות סריקה לשבת ליד המטוסים telecentric עם stationary, חזרה אובייקטיבי פתח המטוס. זוגות של עדשות בין המטוסים נייח לפעול להעביר את קורות סרוקות. הראשון שתי עדשות ממסר יש אורכי מוקד שווה, להרכיב טלסקופ 01:01. הזוג השני של עדשות, הידוע רשמית העדשה לסרוק העדשה צינור, לא צריך להיות שווה אורך מוקד, ולעתים קרובות לשמש טלסקופ קרן הרחבת כדי להבטיח את המטרה גב הצמצם הוא יתר על המידה. האור הנפלט מן המדגם נוסע בחזרה דרך מערכת סריקה עובר דרך המראה dichroic. העדשה למקד את האור מתמקד קצר פליטה דרך חריר confocal, אשר collimated מכן על ידי העדשה. העדשה מתמקדת הסופי פליטת confocal-מסונן על גבי צינור מכפיל. לחץ כאן כדי להציג גרסה בגודל מלא של תמונה זו. <img src="/files/ftp_upload/3252/3252fig3b.jpg" alt = "איור 3b" /> באיור 3. (א) תרשים כללי של תוכנית ההתקנה האלקטרוניקה סריקה. אות התייחסות הכוללת של המיקרוסקופ timebase הוא "סנכרון" פלט TTL של המראה ציר מהיר התהודה galvo, אשר מייצר פולסים TTL בסוף כל שורה סרוקים (כלומר, כאשר galvo השלימה מחזור סריקה). זה מספק את האות H-Sync לכרטיס framegrabber. פלט סינכרון של galvo קשור גם ה-V-Sync לוח בקרה, אשר מגדיל באופן הדרגתי מתח המוצא שלו בתגובה הדופק בכל H-Sync על מנת ליצור את צורת גל זיגזג שמניע את ציר סריקה איטית. לאחר כל הקווים נסרקו, ה-V-Sync הלוח מאפס את waveform זיגזג ומייצר הדופק TTL, אשר משמש אות של framegrabber V-Sync. הקלט סופי לכרטיס framegrabber הוא אות אנלוגי מהצינור מכפיל (שים לב PMTs רבים ליצור מתח המוצא שלילי; הקפד תכנון מעגלים שלךד לבחור את החומרה בהתאם). וידאו קצב התמונות נוצרות ומוצגים התוכנה framegrabber Matrox. (ב) השליטה דוגמה מעגל. בעיצוב זה, מתח של הדופק בכל H-Sync הוא "הוסיף" / משולב ב אינטגרטור המגבר אופ כדי ליצור את הרמפה waveform זיגזג, קטניות נספרים במקביל בשלב הדלפק TTL. כאשר המספר הרצוי של קווי הושג (כלומר, כאשר הסריקה סריקה הושלמה), הדלפק יוצר פעיל נמוך "לבצע את" הדופק, אשר מניע את ההדק שמיט כדי ליצור הדופק לאפס עבור אינטגרטור. זו מאפסת הן את המונה ואת אינטגרטור המגבר אופ, מכין את המעגל למחזור הבא. הבחירה רכיב מתאים עושה מעגל זה רלוונטי נרחב במגוון גדלים raster. זוהי רק אחת ליישום, מימושים רבים אחרים אפשריים ועשוי להיות המועדפת בנסיבות מסוימות. כמו כן, מעגל זה מיועד לשימוש עם כרטיס Matrox framegrabbers, אשר לזהות ולתקן שלב התמונה באופן אוטומטי. אם המעגל היא לשמש framegrabbers עם זאת, תיקון שלב המעגלים או תוכנה עשוי להידרש. לחץ כאן כדי להציג גרסה בגודל מלא של תמונה זו. 4. איור תמונה שידור באמצעות צרור סיבים קוהרנטית. ב סכמטית זו, עדשות צידיו של הצרור נמצאים במקום בקנה מידה הן את התמונה מוקרנת על הקלט צרור סיבים כמו גם להרחיב את התמונה על הפלט צרור סיבים. איור 5. דוגמה צרור סיבים רכוב בהר 5-ציר. קטן 1 "בלוק אלומיניום בקוטר השתעמם כך חבילת סיבי תמונה יכול להיות מוכנס. סיבים היה epoxied בתוך בלוק אלומיניום בוטח את החלק העליון והתחתון של הבלוק ליציבות. איור 6. תמונה של מערכת מיקרוסקופיה השלים עם microendoscope המצורפת. כדי להמחיש טוב יותר את שבילי אור, נתיב קרן עירור מצויר בכחול, בעוד פליטת קרן נתיב אחרי המראה dichroic מצויר כקו אדום. איור 7. תמונה דוגמה שנוצר על ידי מערכת וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית confocal. כהה נמוך מכתב במקרה "m" מופיע על רקע הקרינה בהיר של כרטיס ביקור לבן.