Выделение CD133 + печень стволовых клеток для клональной экспансии

Все решения, средств массовой информации, инструменты, фильтры и трубы должны быть стерильными и обращаться с стерильных, чтобы уменьшить риск заражения. Подготовьте все буферы и средств массовой информации 24 часа заранее и хранить при 4 ° C. 1. Паренхимы и не паренхиматозных отделения от целого печени Подготовка раствора фермента для переваривания использованием 15 мл трубки с завинчивающейся крышкой в ​​10 мл стерильной PBS, содержащего 5 мг коллагеназы, 5 мг проназа и 1 мг ДНКазы. Усыпить мыши, используя учреждении, утвержденном (Институциональные уходу и использованию животных комитета) методов, таких как CO 2 удушья. Протрите брюшной области эвтаназии животных с 70% раствором этанола. Используя стерильные инструменты, открытые брюшной полости и печени эксплантов ан-блок. Удалить желчный пузырь от печени эксплантированных. Передача целом печени ламинарного потока капота в закрытом стерильную чашку. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Использование стерильных лезвие бритвы, пропустить через мясорубку печень сКомбинация из нескольких горизонтальных и вертикальных разрезов в течение 1 минуты в стерильную чашку. Место ¼ измельченного целлюлозно печени в 15 мл трубки с 10 мл PBS с коллагеназы, проназа, и ДНКазы с шагом 1.1 выше. Повторите с каждой ¼ рубленой печени. Место труб с ¼ фарш целлюлозно печени и ферментов в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 45 минут, шейкер на 1-2 циклов / секунду. Протирать трубки с 70% этанола после снятия с водяной бани до передачи в ламинарный поток капот. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Процедить усваивается печенью пульпы через 70 микрон сетчатый фильтр, чтобы собрать в стерильную чашку. Используя 2 мл аликвоты стерильного DMEM: F12 среды с 10% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сывороткой, промыть фильтр и используйте резиновые конца поршень шприца, чтобы пюре перевариваются целлюлоза через фильтр. Повторите 5 раз, чтобы общий объем фильтрата примерно 20 мл. Разделите фильтрата на 2 равные 15 ламп мл. Все переводы должны быть завершены в ла-Минар потоком воздуха, а также использовать охлаждаемой центрифуге при 4 ° C, если доступно. Центрифуга на 50 мкг на 1 минуту. Сохранить супернатант № 1 и выбросить паренхиматозных гранул. Центрифуга супернатант № 1 при 50 мкг на 1 минуту. Сохранить супернатант № 2 и отбросить гранул. Центрифуга супернатант № 2 при 50 мкг на 1 минуту. Сохранить супернатант № 3 и выбросить гранул. Центрифуга окончательного супернатант № 3 на 180 мкг в течение 8 минут, чтобы получить не-паренхиматозные фракции. 2. Красный лизис клеток Работа в ламинарный поток капота, держать клетки холодно, и использование решений охлаждают до 4 ° C. В ночь перед процедурой подготовки красного буфера для лизиса клетки путем разбавления в 10 раз концентрации складе BD Pharm Lyse буфер разведении 1:10 стерильной дистиллированной водой. 1X solutionshould храниться в течение 30 дней при 4 ° C. В ночь перед процедурой подготовки Miltenyi буфера с помощью стерильного PBS, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, и 2 мМ ЭДТА. Фильтр решения с помощью вакуум-фильтраблок с фильтром 0,45 мкм. Крышка верхней части кантователь устройство с оригинальной пластиковой крышкой и закрепите с помощью пластиковой пленкой. Storeentire фильтра при 4 ° С в течение 12 часов для дегазации EDTA. Фильтрующий блок может быть заменен на стандартную стерильной крышкой после 12 часов. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Используя 5 мл стерильной пробирке, вновь приостановить без паренхиматозных гранул, начиная с шага 1.6 выше в 1 мл 1X разбавленный красных клеток крови лизис буфера с 2,1 выше. Закрывают трубку для передачи из ламинаре. Аккуратно вихря для 5 сек и инкубировать 15 минут при 4 ° C в защищенном от света. Центрифуга при 200 х г в течение 5 минут. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Откажитесь лизированных эритроцитов в супернатант, и вновь приостановить гранул в 1 мл ледяного буфера и стерильные Miltenyi. Центрифуга при 200 х г в течение 5 минут. Эта процедура завершена в ламинарном боксе. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 1 мл ледяной и стерильныйMiltenyi буфера. Удалить 10 мкл суспензии клеток PBS и добавить 10 мкл синие tryan. Граф remainingnon-паренхиматозных клеток с использованием гемоцитометра. 3. CD45 гемопоэтические клетки от истощения, не паренхиматозных фракции Работа в ламинарный поток капота, держать клетки холодно, и использование решений охлаждают до 4 ° C. Приостановить клеток в 100 мкл буфера Miltenyi на 107 клеток до 108 общего числа клеток. Применяют 20 мкл Miltenyi CD45 Microbead антител для каждого 107 клеток и инкубировали при 4 ° С в течение 15 минут. Добавить еще 2 мл Miltenyi буфера и центрифугируют при 200 х г в течение 5 минут. Удалить супернатант. Повторное приостановить осадок клеток (до 108 общего числа клеток) в 1 мл буфера Miltenyi. В ламинарного потока капот, фильтр клеток с использованием магнитных Miltenyi LD колонки. Начнем с размещения колонки в магнитный держатель (Miltenyi MidiMACS или QuadroMACS). Поместите стерильный 5 мл трубки ниже фильтра поймать фильтрата. Подготовка колонки при загрузке 2 мл MilteNyi буфера. После предварительного фильтра стирки завершится, загрузите клеток на колонке LD. После клеточной суспензии находится в пределах колонки, добавляют 1 мл Miltenyi буфер и повторить 1 мл промывочного буфера Miltenyi 2 дополнительных раза. Не используйте поршень снабжен колонке, чтобы увеличить скорость фильтрации. Только собирают фильтрат, когда фильтр помещен в магнитный держатель. Центрифуга собранных фильтрата примерно 5 мл (столбец содержит оставшиеся 1 мл) CD45-обедненного без паренхиматозных клеток при 200 х г в течение 5 минут. Откажитесь от колонки с сохранены CD45-положительных клеток. 4. Проточной цитометрии изоляции CD133-положительных клеток Подготовка овальной СМИ ячейки. Используйте 1:01 DMEM: F12 среду с 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки в качестве базового, а также добавлять инсулин (1 мкг / мл) HEPES (5 моль / л) и пенициллина / стрептомицина (1% объем / объем). Фильтр решения с использованием вакуумного фильтра с фильтром 0,45 мкм. Повторное приостановить клеток в буфере Miltenyi при 100 μЛ на 10 7 клеток. Добавить 2 мкл CD133-PE конъюгированных антител. Использование второй группы клеток, инкубировали с IgG-PE конъюгированных антител в качестве контроля. Сохранил третью группу клеток без окрашивания, как неокрашенные управления для FACS. Инкубировать при 4 ° C в течение 15 минут в темноте. Повторное приостановить в 2 буфера окрашивания мл. Центрифуга при 200 х г в течение 5 минут. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 1 мл буфера Miltenyi. Этот этап проводится с использованием стандартных проточной цитометрии сортировки клеток процедур, которые могут быть конкретные учреждения. Использование неокрашенных клеток и IgG PE окрашенных клеток, настроить параметры сортировки для оптимизации стробирования CD133 + клетки населения. PE (R-Phytoerythrin) в общем случае может быть использован с любым проточной цитометрии, который имеет лазер, который излучает при 488 нм. Пик эмиссии для ПЭ 575 нм и обнаруживается в FL-2 канала. Примечание: Использование BD FACS Calibur или BD FACS Vantage машины, с помощью программы Cell Quest для сбора данных, мы используем вперед Scatteг и бокового рассеяния зрения в логарифмической шкале для выявления клеточных популяций, с боковой разброс установлен в 250. FL1 и FL2 оба в логарифмической шкале и установить до 550. Эти параметры обеспечивают начальную отправную точку для просмотра печени, не паренхимных клеток, и корректируются по мере необходимости на основе интенсивности окрашивания положительных и отрицательных населения. Изолировать CD133 + клеток населения, использующего CD133 + ворота и собирают клетки в стерильной фильтрации СМИ ячейки. 5. Методы клеточной культуры Центрифуга FACS собранные клетки при 200 мкг в течение 5 минут. Повторное приостановить осадок клеток в клетки овальной СМИ, приблизительно с 5000 клеток на мл. Может начать с более высокими концентрациями, до 50000 клеток / мл в течение первых экспериментов, а также уменьшить как техника улучшает и общую жизнеспособность клеток и улучшает выход. Пластина клеток на BD Biocoat Ламинин покрыты 96-луночные планшеты с использованием 1000 клеток / см 2. Место в увлажненном культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° C, 5% CO 2. После 24 часов, добавить фактор роста гепатоцитов (50 нг / п) и эпидермальный фактор роста (20 нг / мл). Для одной клетки, изолировать клетки прямо в 50 мкл овальной СМИ ячейки в каждую лунку 96-луночных Ламинин покрытием пластины. Используйте одну ячейку FACS параметры строгий отбор одного положительного клетки только. После 24 часов, добавить 50 мкл овальной СМИ ячейки с HGF и EGF, как указано выше в пункте 5.2. Изменение СМИ полностью через 5-7 дней. После расширения колоний более 50% вырожденная, что обычно происходит через 2 недели, в зависимости от общего числа посеянных клеток и жизнеспособность клеток, клетки могут быть разделены 1:03, как показано ниже. Сплит клеток, используя трипсин 0,05%-EDTA. Примените достаточно, чтобы покрыть дно колодца, 50-100 мкл / лунку на 96-луночный планшет. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 3-5 минут. Добавить 100 мкл средств массовой информации в каждую ячейку и передать все жидкости 5 мл трубки. Добавить 1 мл среды в каждую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 минут. Повторное приостановить клеток в пластине средств массовой информации яп ламинин покрытием блюдо, с использованием клеток от 1 и до тарелки на 3 скважинах новые (1:3 отношение). 6. Подтверждение би-статус потенциального использования RT-PCR Эта процедура подробно описана в RNeasy протокол руководство, которое поставляется в комплекте с RNeasy Kit. Используйте RNeasy микро-колонки для 96-луночных колонии пластины. Аспирируйте культуру средств массовой информации из каждой лунки. Добавить 75 мкл буфера RLT (от RNeasy Kit) непосредственно в каждую лунку. Очистите нижней плиты со стерильными резиновыми полицейский. Pipettelysate в микро-центрифуге трубки и вихрем смеси в течение 1 минуты. Добавить 70% этанола лизатов и перемешать с помощью пипетки. Передача решения RNeasy колонку помещали в 2 мл пробирки (поставляется в RNeasy Kit) и центрифуги в микро-центрифуге в течение 15 секунд при 10000 оборотах в минуту. Откажитесь Элюированную фильтрата. Повторное использование коллекции трубки. Добавить 350 мкл буфера RW1 (RNeasy Kit) для RNeasy колонку и центрифуги в течение 15 секунд при 10000 оборотов в минуту, чтобы вымыть колонкимембрану. Откажитесь Элюированную стирки. Добавить 10 мкл ДНКазы I маточного раствора до 70 мкл буфера RDD (оба поставляются в RNeasy Kit). Добавить 80 мкл ДНКазы I буфера RDD инкубации смеси для RNeasy мембраны колонки и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре. Добавить 350 мкл буфера RW1 (RNeasy комплект) к RNeasy колонку и центрифуги в течение 15 секунд при 10000 оборотов в минуту для мытья мембран. Откажитесь Элюированную стирки и пробирки. Поместите RNeasy колонке в новом 2 мл пробирки (поставляется в комплекте RNeasy). Добавить 500 мкл буфера RPE (RNeasy Kit) для RNeasy колонку и центрифуги в течение 15 секунд при 10000 оборотов в минуту для мытья мембран. Откажитесь Элюированную стирки. Подготовить 80% этанола использованием РНКазы воды (RNeasy Kit). Добавить 500 мкл 80% этанола в RNeasy центрифуги columnand в течение 2 минут при 10000 оборотах в минуту. Откажитесь Элюированную стирки. Поместите RNeasy колонке в новом 2 мл пробирки (RNeasy Kit) и центрифугу на полной скорости в течение 5 минут. Откажитесь от любых Элюированную стирки и коллеглекция трубку. Поместите RNeasy колонку в новой 1,5 мл пробирки (RNeasy комплект). Добавить 14 мкл РНКазы воды (RNeasy Kit) к центру мембраны колонны и центрифуги в течение 1 минуты на полной скорости. Сбор фильтрата с очищенной РНК и передать на лед, если создание кДНК сразу или хранить при температуре минус 80 ° C для дальнейшего использования. Обратная транскрипция использованием ингибитора РНКазы Omniscript.Dilute до конечной концентрации 10 ед / мкл в ледяной 1x буфер РТ. Vortex в течение 5 секунд, и пульс центрифуги в течение 5 секунд. Подготовка свежей смеси мастер на льду в соответствии с стр. 13 протокола Omniscript. Vortex в течение 5 секунд, и пульс центрифуги в течение 5 секунд. Рекомендовать подготовить объема Mastermix 10% больше, чем требуется для полного обязательным для всех реакций. Добавить матричной РНК на отдельные пробирки, содержащие основную смесь. Vortex в течение 5 секунд, и пульс центрифуги в течение 5 секунд. Инкубировать в течение 60 мин при 37 ° C. ПЦР-амплификации гепатоцитов(Альбумин) и cholangiocyte конкретных генов с помощью HotStarTaq ДНК-полимеразы. Подготовка реакционной смеси на странице 15 книги HotStarTaq протокол. Рекомендовать разбавления складе праймеров для концентрации 20 часов / мкл, а с 1 мкл / реакционной трубы используются для прямого и обратного праймеров. В зависимости от количества клеток первоначально использовались для выделения РНК, мы рекомендуем деления окончательного кДНК среди 3 реакционных труб (β-актин для контроля загрузки, альбумин и KRT19), чтобы начать. ПЦР-праймеров приведены в таблице 1. Поместите реакционных труб в амплификатор. Рекомендовать следующую программу для начальных экспериментов: 95 ° КСОР 15 минут х 1 цикл следуют 95 ° C в течение 30 секунд, 55 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 30 секунд х 35 циклов, затем 72 ° С в течение 10 минут. Продукты ПЦР анализировали с помощью бромистого этидия пропитанные агарозном геле. 7. Подтверждение опухоли потенциал CD133 + стволовых клеток Эта процедура можетбыть сделано с свежевыделенных клеток, начиная с шага 4 или с использованием клеток, которые культивировали с шага 5. Мы рекомендуем выполнять первые эксперименты с культивируемых клеток, а свежевыделенных клеток будет сокращен жизнеспособности и снижению урожайности. Trypsinize клеток, используя трипсин 0,05%-EDTA с шагом 5.5 выше. Через 3-5 минут инкубации при 37 ° С, добавить 100 мкл среды в каждую лунку и передать всю жидкость из каждой лунки отдельных труб 5 мл (1 а = 1 трубка). Добавить 1 мл среды в каждую пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 минут. Повторное приостановить клеток в 1 мл ледяной PBS. Удалить 10 мкл суспензии клеток PBS и добавить 10 мкл трипанового синего. Использование исключения трипанового синего, определяют количество живых клеток. При использовании FACS изолированных клеток, число клеток будет определяться по количеству изоляции FACS. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 минут и повторно суспендируют в PBS в концентрации 1 х 10 6 живых клеток/100 мкл. Добавить 100 мкл Matrigel. Шесть-недельных иммунной дефицитом Nudэлектронной мышам вводили подкожно использовании 28 gague иглы. Вводят 1 х 10 6 клеток в 200 мкл на сайте. Мыши контроль роста опухоли ежедневно. После образования опухолей, как правило, после инкубации 3-4 недели, объем опухоли измеряют с помощью суппортов (высота х длина х ширина). 8. Представитель Результаты: Из нормальных, здоровых мышиной печени, ожидаемая доходность сотовой CD133 + клеток печени стволовыми в 1000 до 5000 в печень. Эти клетки являются относительно редкими в печени и покоя не будет расширяться и в культуре. Мы не рекомендуем использовать одну ячейку на анализе нормальной печени и выход жизнеспособных клеток, что будет расширять является крайне низким. Для печени со значительной хронической травмы, такие, как DDC 0,1% диету в течение 6 недель 1 или генетической модификации в результате хронической травмы, такие как MAT1a – / – или печени конкретные Pten – / – мышей, 2-4 ожидаемое число челLs изолированным увеличением до 100000 клеток изолированного / печень (рис. 2). При использовании генетических моделей, знание спонтанных опухолей является критическим, так как эти процедуры для печени изоляции стволовых клеток должны проводиться в опухоли бесплатно животные. Например, если MAT1a – / – типовые формы спонтанных опухолей на 18 месяцев, мы рекомендуем использовать животных не позднее чем через 15-16 месяцев, до любого сообщил спонтанных опухолей. Выделение отдельных клеток от хронической травмы моделей даст несколько (3-9 colonies/96 и пластины) колонии, которые расширяются от отдельных клеток после процедуры освоены, и жизнеспособность клеток обеспечивается. Рисунок 3 настоящего представителя фазового контраста изображения колонии, полученные из одного CD133 + клеток расширена через 7 дней. Подтверждение би-статус потенциального проводится с использованием альбумина и Krt19 RT-PCR. Колонии с расширенным одной клетки будут демонстрировать как выражение для маркеров гепатоцитов (AlБумин) и холангиоцитов (Krt19). Рисунок 4 показывает би-потенциал выражение из трех изолированных колоний, около 25 клеток / колонию на 7 дней. CD133 + стволовые клетки из нормальной печени и химически индуцированных повреждений печени (например, DDC 0,1% диету в течение 6 недель) не образуют опухолей у голых мышей. CD133 + стволовые клетки из специфических генетических моделей (MAT1a – / – или печени конкретные Pten – / – мышей) образуют опухолей у голых мышей, если изолирован поздно в конце предварительной опухоли хронической фазе травмы. Эта опухоль формировании фенотипа в настоящее время определены как стволовые клетки рака 2-4 Например, MAT1a -. / – Мышей образуют спонтанных опухолей печени в возрасте 18 недель. CD133 + печень стволовые клетки, выделенные в 15-16 недель, в течение поздней хронической фазе травмы заболевания печени, образуют опухолей у голых мышей. На рисунке 5 показано, представитель опухоли из двусторонних инъекции 1 х 10 6 клеток в пробирке расширен с одного CD133 + стволовых клеток печенис. Ген Прямой праймер Обратный праймер β-актина 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' Альбумин 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' Кератин 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' Таблица 1: грунтовка дизайн для RT-PCR Рисунок 1: Общая схема методов. Рисунок 2: CD133 + печени стволовыми клетками, выявленных в высокообогащенного CD45 обедненного без паренхиматозных фракции управления неповрежденной печени от дикого типа. мышах показано, 0,4% CD133 + клеток в высоко обогащенного CD45 обедненного без паренхиматозных фракции. В генетическом нокаут MAT1a – / -, который представляет собой модель хронического поражения печени, население CD133 расширяется в 10 раз и более в то же высоко обогащенного фракции. Рисунок 3: Расширение колоний от одного CD133 + клоны фазового контраста изображения четырех колоний, полученные из одного CD133 + клеток расширил покрытие на ламинине 96-луночных планшетах.. Рисунок 4: Bi-потенциал экспрессии гена CD133 + из печени стволовыми клетками клонально расширен колоний на 7 день, колонии около 25 клеток.. Экспрессия генов демонстрирует выражение гепатоцитов маркер альбумин и cholangiocyte маркер Krt19, подтверждающие би-потенциал статус CD133 + клеток. ve_content "> Рисунок 5: CD133 + клеток печени стволовыми образуют опухолей у голых мышей Стрелки указывают опухоли, растущие через 4 недели после 1×10 6 CD133 + клетки, введенные с MAT1a – / – модель.. CD133 + клеток от токсинов индуцированные хроническим поражением печени, таких как CCl 4 или 0,1% DDC диету, не образуют опухолей. Образование опухолей используется для идентификации злокачественным потенциалом, или раковые стволовые клетки фенотипа в популяции стволовых клеток.