El aislamiento de células madre CD133 + hígado para la expansión clonal

Todas las soluciones, los medios de comunicación, instrumentos, filtros y tubos deben ser estériles y manipularse con una técnica estéril para reducir el riesgo de contaminación. Prepare todos los tampones y los medios de comunicación 24 horas de antelación y almacenar a 4 ° C. 1. Separación del parénquima y no parénquima del hígado de todo Prepare la solución de enzimas para la digestión con un tubo de 15 cc con tapón de rosca de 10 ml de PBS estéril que contiene 5 mg de colagenasa, 5 pronasa mg y 1 mg DNAsa. Eutanasia ratón usando institución aprobada (Cuidado de Animales institucional y el empleo) como método de asfixia de CO 2. Limpie el área abdominal de los animales sacrificados con una solución de etanol al 70%. Utilizando instrumentos estériles, de la cavidad abdominal abierta y el hígado explante en bloque. Quitar la vesícula biliar del hígado explantado. Transferencia de hígado en su totalidad a la campana de flujo laminar en un molde cerrado estéril. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Usando una hoja de afeitar estéril, carne picada de hígado con una combinación de varios cortes horizontales y verticales durante 1 minuto en una fuente estéril. Colocar ¼ de pulpa de hígado picado en el tubo de 15 cc con 10 cc de PBS con colagenasa, pronasa, ADNasa y desde el paso 1.1. Repita el procedimiento con cada uno de hígado picado ¼. Se colocan los tubos de pasta de hígado picado ¼ y de las enzimas en el baño de agua a 37 ° C durante 45 minutos, con agitación a 1-2 ciclos / segundo. Limpie los tubos con etanol al 70% después de la eliminación del baño de agua antes de la transferencia de campana de flujo laminar. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Cuele la pulpa digerida del hígado a través de 70 micras de malla del filtro para recoger en un recipiente estéril. Utilizando alícuotas de 2 ml de DMEM estéril: los medios de comunicación F12 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino, lavar el filtro y el uso final de goma de un émbolo de la jeringa para triturar la pulpa digerida a través del filtro. Repita 5 veces para que el volumen total de aproximadamente 20 ml de filtrado. Dividir el filtrado en dos tubos iguales de 15 ml. Todas las transferencias deben ser completado en campana de flujo laminar, y el uso de centrífuga refrigerada a 4 ° C si está disponible. Se centrifuga a 50 g durante 1 minuto. Guardar el sobrenadante # 1 y desechar parénquima pellet. Centrifugar el sobrenadante # 1 a 50 xg durante 1 minuto. Guardar el sobrenadante # 2 y descartar pellet. Centrifugar el sobrenadante # 2 a 50 xg durante 1 minuto. Guardar el sobrenadante # 3 y descartar pellet. Centrifugar el sobrenadante final # 3 de 180 g durante 8 minutos para obtener no parenquimatosas fracción. 2. Lisis de glóbulos rojos El trabajo en campana de flujo laminar, mantener las células en frío, y las soluciones de uso se enfría a 4 ° C. La noche antes del procedimiento, preparar buffer rojo lisis celular mediante la dilución de 10 veces la concentración de las BD Pharm Lyse buffer con una dilución 1:10 con agua destilada estéril. 1X solutionshould ser almacenado durante 30 días a 4 ° C. La noche antes del procedimiento, preparar buffer Miltenyi con PBS estéril, un 0,5% de albúmina de suero bovino y 2 mM EDTA. Filtrar la solución con unidad de filtro de vacío con filtro de 0,45 micras. Cubierta superior de la unidad de volcador con tapa de plástico original y seguro con una envoltura de plástico. Storeentire filtro de la unidad a 4 ° C durante 12 horas para desgasificar EDTA. Unidad de filtro se puede reemplazar con tapa estándar estériles después de 12 horas. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. El uso de un tubo de 5 ml estéril, una nueva suspensión no parenquimatosas de pellets a partir del paso por encima de 1,6 a 1 ml de 1X tampón diluido lisis de glóbulos rojos a partir de 2.1. Tape el tubo de transferencia de la campana de flujo laminar. Suavemente vórtice de cinco segundos e incubar durante 15 minutos a 4 ° C protegido de la luz. Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Deseche los eritrocitos lisados ​​en el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de Miltenyi helada y estéril. Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de Miltenyi helada y estéril. Retire 10 l de suspensión celular PBS y se añaden 10 l azul tryan. Conde remainingnon del parénquima células utilizando un hemocitómetro. 3. CD45 agotamiento de las células hematopoyéticas de la fracción no parenquimatosas El trabajo en campana de flujo laminar, mantener las células en frío, y las soluciones de uso se enfría a 4 ° C. Suspender las células en 100 l de tampón Miltenyi por 107 células de hasta 108 células totales. Aplicar 20 l Miltenyi anticuerpos CD45 microesferas por cada 107 células y se incuba a 4 ° C durante 15 minutos. Añadir adicional de 2 ml de tampón de Miltenyi y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Eliminar el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular (hasta 108 células en total) en 1 ml de tampón de Miltenyi. En campana de flujo laminar, las células de filtro con Miltenyi columna LD magnético. Comience por colocar la columna en soporte magnético (MidiMACS Miltenyi o QuadroMACS). Lugar estériles de 5 ml por debajo de tubo de filtro para atrapar filtrado. Preparar la columna por la carga de Milte 2 mlnyi buffer. Una vez pre-filtro de lavado es completo, las celdas de carga sobre la columna de LD. Una vez que la suspensión de células se encuentra dentro de la columna, agregar 1 ml de tampón de Miltenyi y repetir 1 ml de solución de lavado Miltenyi dos veces más. NO utilice el émbolo provisto de columna para aumentar la velocidad de filtración. Sólo recogemos filtrado cuando el filtro de colocado en el soporte magnético. Centrifugar el filtrado recogido de aproximadamente 5 ml (la columna tiene el restante 1 ml) de CD45-agotado células no parenquimatosas a 200 xg durante 5 minutos. Desechar la columna con la conserva células CD45 positivas. 4. Flujo de aislamiento citometría de células CD133 positivas Prepare los medios de comunicación oval de la célula. Use 01:01 DMEM: medio F12 con 10% inactivado por calor suero fetal bovino como base, y añadir la insulina (1 mg / ml), HEPES (5 mol / L) y penicilina / estreptomicina (1% volumen / volumen). Filtrar la solución con unidad de filtro de vacío con filtro de 0,45 micras. Vuelva a suspender las células en tampón Miltenyi a 100 l por 10 7 células. Añadir 2 l de CD133-PE anticuerpo conjugado. El uso de un segundo grupo de células, se incuban con IgG-PE anticuerpo conjugado como un control. Mantener un tercer grupo de células sin manchar como un control de mancha de FACS. Incubar a 4 ° C durante 15 minutos en la oscuridad. Vuelva a suspender en 2 ml de buffer de tinción. Centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón de Miltenyi. Este paso se lleva a cabo utilizando procedimientos estándar de citometría de flujo clasificación de células, que pueden ser específicas de la institución. El uso de células sin teñir y IgG células PE de colores, ajustar los parámetros de clasificación de gating optimizada de CD133 + población de células. PE (R-Phytoerythrin) en general, se puede utilizar con cualquier citómetro de flujo que tiene un láser que emite a 488 nm. El pico de emisión de la EP es 575 nm y se detecta en el canal FL-2. Nota: El uso de un BD FACS Calibur o máquinas BD FACS Vantage, con el programa Cell Quest para la recolección de datos, utilizamos Adelante vista de dispersión y dispersión lateral en la escala de registro para identificar las poblaciones de células, con dispersión lateral establecido en 250. FL1 y FL2 son tanto en escala logarítmica y se puso a 550. Estos parámetros proporcionan un lugar de partida inicial para ver el hígado células no parenquimatosas, y se ajustan según sea necesario sobre la base de intensidad de la tinción de las poblaciones positivas y negativas. Aislar el CD133 + población de células con CD133 + puerta y recoger las células en los medios de comunicación celular estéril filtrada. 5. Métodos de cultivo celular FACS centrífuga recolectaron células a 200 xg durante 5 minutos. Vuelva a suspender el sedimento celular en los medios de comunicación de células ovaladas, con aproximadamente 5000 células por ml. Puede comenzar con concentraciones más altas, de hasta 50.000 células / ml para los experimentos iniciales, y reducir a medida que mejora la técnica y la viabilidad de las células y mejora el rendimiento general. Células de la placa en BD Biocoat laminina recubierto con placas de 96 y 1000 células / cm 2. Lugar en cultivo de células humidificado incubadora a 37 ° C, con 5% de CO 2. Después de 24 horas, añadir el factor de crecimiento de hepatocitos (50 ng / nl) y factor de crecimiento epidérmico (20 ng / ml). De las células individuales, aislar las células directamente en 50 l de los medios de comunicación celular oval en cada pocillo de una placa de 96 pocillos recubiertos laminina. De un solo uso celular FACS la configuración de una estricta selección de una célula positivos. Después de 24 horas, se añaden 50 l de los medios de comunicación celular oval con HGF y EGF que el anterior en el paso 5.2. Cambiar los medios de comunicación totalmente después de 5-7 días. Una vez que las colonias están en expansión superior al 50% confluentes, que normalmente ocurre después de 2 semanas, dependiendo del número total de células viabilidad plateado y celular, las células se pueden dividir 1:03 de la siguiente manera. Las células se dividen con tripsina 0,05%-EDTA. Aplique la cantidad suficiente para cubrir bien el fondo, desde 50 hasta 100 l / pocillo de placa de 96 pocillos. Lugar en la incubadora a 37 ° C durante 3-5 minutos. Añadir 100 ml de los medios de comunicación a cada pocillo y la transferencia de todo el líquido a un tubo de 5 ml. Añadir 1 ml de medio en cada tubo y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Vuelva a suspender las células en la placa de los medios de comunicación en un plato recubierto de laminina, utilizando células de un bien a la placa en 3 nuevos pozos (1:3). 6. La confirmación de la bi-potencial de estado mediante RT-PCR Este procedimiento se detalla en el manual RNeasy protocolo, que se suministra con el kit RNeasy. Use RNeasy columnas micro para 96 ​​colonias y placa. Aspirar los medios de cultivo de cada pocillo. Añadir 75 l RLT buffer (de Kit RNeasy) directamente a cada pocillo. Raspar la placa inferior con policía de goma estéril. Pipettelysate en el tubo de microcentrífuga y la mezcla de vortex durante 1 minuto. Agregar 70% de etanol a lisados ​​y mezclar con la pipeta. Transferir la solución a la columna RNeasy coloca en un tubo de 2 ml de recolección (que se suministra en el kit RNeasy) y se centrifuga en microcentrífuga durante 15 segundos a 10.000 rpm. Deseche eluye filtrado. Volver a utilizar el tubo de recolección. Añadir 350 l de búfer RW1 (RNeasy Kit) a la columna RNeasy y centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm para lavar la columnamembrana. Deseche lavar eluido. Añadir 10 l DNasa solución madre I a 70 l Buffer RDD (ambos suministrados en el kit RNeasy). Agregar los 80 l DNasa I Buffer mezcla de incubación RDD a la membrana de la columna RNeasy e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. Añadir 350 l de búfer RW1 (RNeasy kit) a la columna RNeasy y centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm para lavar la membrana. Deseche lavado eluye y tubo de recolección. Colocar la columna de RNeasy en un nuevo tubo de 2 ml de recogida (suministrado en el kit RNeasy). Añadir 500 l Buffer RPE (RNeasy Kit) a la columna RNeasy y centrifugar durante 15 segundos a 10.000 rpm para lavar la membrana. Deseche lavar eluido. Preparar etanol al 80% con agua libre de RNasa (RNeasy Kit). Añadir 500 l de etanol al 80% de la centrífuga columnand RNeasy durante 2 minutos a 10.000 rpm. Deseche lavar eluido. Colocar la columna de RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 2 ml (RNeasy Kit) y se centrifuga a máxima velocidad durante 5 minutos. Deseche cualquier lavado de eluido y tubo de recolección. Colocar la columna de RNeasy en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml (kit RNeasy). Agregar 14 l agua libre de RNasa (RNeasy Kit) para el centro de la membrana de la columna y centrifugar durante 1 minuto a máxima velocidad. Recoger filtrado con ARN purificado y traslado al hielo si la creación de cDNA inmediatamente o almacenar a temperaturas de 80 ° C para su uso futuro. Transcripción reversa utilizando Omniscript.Dilute inhibidor de RNasa a una concentración final de 10 unidades / l en el helado RT 1x Buffer. Vortex durante 5 segundos y centrifugar el pulso durante 5 segundos. Prepare una mezcla maestra fresco en hielo de acuerdo a la página 13 de Omniscript protocolo. Vortex durante 5 segundos y centrifugar el pulso durante 5 segundos. Recomienda a preparar un volumen de mastermix 10% mayor que la necesaria para el total requerido para todas las reacciones. Añadir plantilla de ARN de los tubos individuales que contienen la mezcla maestra. Vortex durante 5 segundos y centrifugar el pulso durante 5 segundos. Incubar durante 60 min a 37 ° C. Amplificación por PCR de genes específicos de hepatocitos (albúmina) y cholangiocyte usando la polimerasa de ADN HotStarTaq. Prepare la mezcla de reacción por la página 15 de HotStarTaq libro de protocolo. Recomiendan diluir cartillas de valores a la concentración de 20 pm / l, y con 1 l / reacción de tubo que se usa para adelante y atrás. Dependiendo del número de células inicialmente utilizado para la extracción de ARN, se recomienda dividir final de ADNc entre los tres tubos de reacción (β-actina para el control de carga, la albúmina y KRT19) para empezar. PCR primer diseño se muestra en la Tabla 1. Coloque los tubos de reacción en el termociclador. Recomendamos el siguiente programa para los experimentos iniciales: 95 ° CFOR 15 minutos x 1 ciclo seguido de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 30 segundos x 35 ciclos, seguido de 72 ° C durante 10 minutos. Los productos de PCR se analizaron con bromuro de etidio impregnadas en gel de agarosa. 7. La confirmación del potencial de tumor de células madre CD133 + Este procedimiento puede realizarse con células recién aisladas desde el paso 4 o el uso de células que han sido cultivadas desde el paso 5. Se recomienda realizar los primeros experimentos con cultivos de células, como células recién aisladas se ha reducido la viabilidad y rendimiento reducido. Trypsinize células con tripsina-EDTA al 0,05% desde el paso por encima de 5,5. Después de 3-5 minutos de incubación a 37 ° C, añadir 100 ml de los medios de comunicación a cada pocillo y la transferencia de todo el líquido de cada pocillo a los distintos tubos de 5 ml (1 y = 1 metro). Añadir 1 ml de medio en cada tubo y centrifugar a 200 xg durante 5 minutos. Vuelva a suspender las células en 1 ml de PBS frío. Retire 10 l de suspensión celular PBS y se añaden 10 l azul tripano. Utilizando azul de tripan exclusión, determinar el número de células vivas. Si está usando FACS células aisladas, el número de células será determinado por el recuento de aislamiento FACS. Las células se centrifugan a 200 xg durante 5 minutos y se resuspendieron en PBS a una concentración de 1 x 10 6 l células/100 vivir. Añadir 100 l Matrigel. Seis semanas de edad ratones inmunodeficientes desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con 28 agujas gague. Inyectar 1 x 10 6 células en 200 l por cada sitio. Los ratones son monitoreados por el crecimiento del tumor al día. Una vez que se forman tumores, por lo general después de la incubación de 3-4 semanas, el volumen del tumor se mide con pinzas (alto x largo x ancho). 8. Los resultados representativos: De hígado normal, saludables murino, el rendimiento esperado celular de las células madre CD133 + hígado es de 1.000 a 5.000 por el hígado. Estas células son relativamente raros en el hígado en reposo y no se ampliará también en la cultura. Nosotros no recomendamos el uso de análisis de células individuales en el hígado normal y el rendimiento de células viables que se extenderá es extremadamente bajo. De hígados con lesiones crónicas importantes, como la dieta DDC 0,1% durante 6 semanas una o la modificación genética que resulta en una lesión crónica, como la MAT1a – / – o PTEN específica del hígado – / – ratones, 2-4 el número esperado de cells aislado aumenta, con un máximo de 100.000 células aisladas / hígado (Figura 2). Si el uso de modelos genéticos, los conocimientos de la tasa de tumores espontáneos es fundamental, ya que estos procedimientos para el aislamiento de células madre del hígado debe ser llevado a cabo en el tumor de animales en libertad. Por ejemplo, si el MAT1a – / – modelos de formularios tumores espontáneos a los 18 meses, se recomienda el uso de animales a más tardar el 15 a 16 meses, antes de los tumores reportados espontánea. El aislamiento de células individuales de los modelos de lesión crónica dará varias (3-9 colonies/96 y placa) colonias que se expanden a partir de células individuales una vez que el procedimiento se domina, y la viabilidad celular está garantizada. Figura 3 se presentan imágenes representativas de contraste de fase de colonias derivadas de una sola células CD133 + ampliado después de 7 días. La confirmación de la bi-estado potencial se lleva a cabo usando albúmina y Krt19 RT-PCR. Las colonias de células individuales se amplió demostrar tanto la expresión de marcadores de los hepatocitos (albúmina) y cholangiocytes (Krt19). Figura 4 muestra bi-expresión potencial de tres colonias aisladas, con aproximadamente 25 células / colonia en 7 días. CD133 + células madre de hígado normal y las lesiones hepáticas inducidas químicamente (por ejemplo, la dieta DDC 0,1% durante 6 semanas) no se forman tumores en ratones desnudos. CD133 + células madre específicas de los modelos genéticos (MAT1a – / – o PTEN específica del hígado – / – ratones) se forman tumores en ratones desnudos si se aísla a finales a finales de la fase pre-tumor lesión crónica. La formación de este fenotipo tumoral ha sido identificada como una célula madre del cáncer de 04.02, por ejemplo, la MAT1a -. / – Ratones se forman los tumores de hígado espontáneo a las 18 semanas de edad. CD133 + células madre hepáticas aisladas de 15-16 semanas, durante una fase de lesión crónica tardía de la enfermedad hepática, se forman tumores en ratones desnudos. La Figura 5 muestra los tumores representante de la inyección bilateral de 1 x 10 6 células expandidas in vitro a partir de un solo CD133 + células madre del hígado. Gene Primer avance Primer inversa β-actina 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 ' 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3 ' Albúmina 5'-CATGCCAAATTAGTGCAGGA-3 ' 5'-GCTGGGGTTGTCATCTTTGT-3 ' Queratina 19 5'-TGCTGGATGAGCTGACTCTG-3 ' 5'-AATCCACCTCCACACTGACC-3 ' Tabla 1: Primer diseño de RT-PCR Figura 1: Esquema general de los métodos. Figura 2: CD133 + células madre del hígado identificados en altamente enriquecido CD45 agotado no parenquimatosas del hígado fracción de Control ileso de ratones de tipo salvaje demuestra un 0,4% CD133 + células en el altamente enriquecido CD45 agotado no parenquimatosas fracción.. En la estructura genética de knock-out MAT1a – / -, que es un modelo de daño hepático crónico, la población CD133 se expande 10 veces o más en la misma fracción altamente enriquecido. Figura 3: Ampliación de las colonias de un solo CD133 + clones de contraste de fase imágenes de cuatro colonias derivadas de una sola células CD133 + expandido recubierto de laminina placas de 96 pocillos.. Figura 4:. Bi-potencial de la expresión génica de células madre CD133 + hígado colonias clonal ampliado en el día 7, las colonias son de aproximadamente 25 células. La expresión de genes demuestra la expresión del marcador de marcador de hepatocitos albúmina y cholangiocyte Krt19, lo que confirma el potencial bi-estado de las células CD133 +. Figura 5: CD133 + células madre del hígado se forman los tumores en ratones desnudos Las flechas indican el crecimiento del tumor a 4 semanas después de 1×10 células CD133 + 6 inyectado desde MAT1a – / – modelo.. CD133 + células de la toxina inducida por la lesión crónica del hígado, como por ejemplo CCl 4 o 0,1% de la dieta DDC, no forman tumores. La formación de tumores se utiliza para identificar el potencial maligno, el cáncer o el fenotipo de las células madre dentro de la población de células madre.