分离的CD133 +肝干细胞的克隆扩增

所有的解决方案，媒体，仪器仪表，过滤器，和管应无菌和无菌技术，以减少污染的风险处理。提前和存储缓冲区和媒体24小时准备在4 ° C。 1。从全肝实质和非实质的分离准备于10 ml无菌PBS含5毫克胶原酶，5毫克链霉蛋白酶，和1毫克DNA酶螺丝顶部使用了15毫升管的消化酶液。 安乐死鼠标使用机构的批准（机构动物护理和使用委员会）的方法， 如 CO 2窒息。用70％的乙醇溶液安乐死动物的腹部。使用消毒，打开腹腔和外植体肝块EN -。取出explanted肝的胆囊。整个肝脏转移到封闭的无菌培养皿中的层流罩。 此过程完成后，在层流罩。用消毒的刀片，直言不讳地削减1分钟，在无菌盘的多个横向和纵向相结合的肝脏。地点¼ 15毫升10 CC PBS用胶原酶，链霉蛋白酶和DNase管从上面的步骤1.1肉末肝纸浆。每个¼肉末肝重复。 广场管¼肉末肝纸浆和酶进入水浴37 ° C为45分钟用振动筛，在1-2次/秒。请用70％乙醇去除水浴前转移到层流罩后管。 此过程完成后，在层流罩。应变通过70微米筛网过滤消化肝脏浆收集到无菌培养皿。使用无菌DMEM培养液2毫升分装：10％热灭活胎牛血清的F12媒体，冲洗过滤器，并通过过滤器使用注射器的柱塞橡胶捣碎消化纸浆。重复5次，滤液约20毫升的总量。分成2等于15 mL管滤液。 完成所有转让应当在层流罩，并在4 ° C如果有使用冷冻离心机。离心为1分钟50 XG。保存上清＃1和丢弃实质颗粒。离心上清为1分钟50 XG＃1。保存上清＃2和丢弃沉淀。离心上清为1分钟50 XG＃2。保存上清＃3和丢弃沉淀。离心机最终上清＃3到8分钟取得非实质的分数为180 XG。 2。红细胞溶解在层流罩，保持细胞的冷和使用的解决方案，冷却至4 ° C。 在手术前的夜晚，准备用1:10稀释用无菌蒸馏水稀释10倍浓度的股票屋宇署医药裂解缓冲的红细胞裂解液。 1X solutionshould存储30天，在4 ° C 在手术前的夜晚，准备Miltenyi缓冲区使用无菌PBS，0.5％牛血清白蛋白和2mm EDTA 。使用0.45微米的过滤器真空过滤机的过滤器解决方案。与原来的塑料盖盖翻车机单元的顶部，并用保鲜膜安全。 Storeentire过滤装置在4 ° C时12小时，德加EDTA的。过滤装置可以取代标准在12小时后的无菌帽。 此过程完成后，在层流罩。使用5毫升的无菌试管，再暂停上述步骤1.6到1毫升1X稀释的红血细胞裂解液从2.1以上非实质颗粒。第传输层流罩管。 轻轻为涡5秒和15分钟的孵育4 ° C避光。 在200 XG离心5分钟。 此过程完成后，在层流罩。丢弃上清液中裂解红细胞，并重新悬浮颗粒在1毫升的冰冷和无菌Miltenyi缓冲区。 在200 XG离心5分钟。 此过程完成后，在层流罩。弃上清，重新悬浮颗粒在1毫升的冰冷和无菌Miltenyi缓冲区。 取出10μLPBS细胞悬液，加入10μLtryan蓝色。使用血球计数remainingnon实质细胞。 3。 CD45的非实质的部分造血干细胞耗竭在层流罩，保持细胞的冷和使用的解决方案，冷却至4 ° C。 暂停100μLMiltenyi每107个细胞的缓冲到108个细胞的细胞。 申请每107个细胞的20微升Miltenyi CD45微珠抗体，4℃孵育15分钟。 添加额外的2毫升Miltenyi缓冲区在200 5分钟XG，离心。去除上清液。重悬细胞沉淀1毫升Miltenyi缓冲液（细胞总数高达108）。 在层流罩，过滤器细胞使用Miltenyi劳工处磁列。通过放置在磁持有人（Miltenyi MidiMACS或QuadroMACS）列开始。将无菌5毫升管下面的过滤器捕捉滤液。准备列装载2毫升MilteNYI缓冲区。 预过滤器洗完成后，加载到ld列细胞。一旦列内的细胞悬液，加入1 ml Miltenyi缓冲区和重复1毫升Miltenyi缓冲液洗2次。不要使用列提供的柱塞，以提高过滤速度。只收集滤液在过滤器时，放置在磁座。 离心收集约5毫升滤液CD45 -枯竭的非实质细胞在5分钟的200 XG（列持有余下的1毫升）。放弃与保留CD45阳性细胞列。 4。流动CD133阳性细胞的流式细胞仪隔离准备卵圆细胞媒体。使用1:1的DMEM：F12培养液，10％热灭活胎牛血清为基础，并添加胰岛素（1微克/毫升），HEPES（5 mol / L的），和青霉素/链霉素（1％体积/体积）。使用0.45微米的过滤器真空过滤机的过滤器解决方案。 暂停Miltenyi缓冲液100μL，每10 7细胞的细胞。加入2μLCD133 – PE标记的抗体。使用第二组的细胞，与孵化的IgG – PE标记的抗体作为对照。作为一个未染色的流式细胞仪控制染色无保留的细胞的第三组。 在4 ° C为15分钟，在黑暗中孵育。重新暂停在2毫升染色缓冲。在200 XG离心5分钟。弃上清，重新悬浮颗粒在1毫升Miltenyi缓冲区。 这一步是使用标准的流式细胞仪检测细胞分选程序，这可能是机构具体进行。使用未染色的细胞和IgG PE染色细胞，调整优化浇注的CD133 +细胞群的排序参数。 PE（R – Phytoerythrin），一般都可以用任何的流式细胞仪，激光发出波长为488。 PE峰值发射575纳米，在FL – 2通道检测。 注意：使用细胞与数据收集任务方案的一个BD流式细胞仪刀魂或BD FACS Vantage的机器，我们使用着散射和侧日志规模的分散，以期查明侧散射的细胞群，设置为250。 FL1和FL2日志规模，并设置为550。这些参数提供一个初始的地方查看肝脏非实质细胞，调整需要根据染色强度的正面和负面的人口。 分离的CD133 +细胞群中使用的CD133 +门，收集细胞，在无菌过滤的细胞介质。 5。细胞培养方法在5分钟的200 XG离心机流式细胞仪收集细胞。重悬细胞卵圆细胞介质中的颗粒细胞每毫升约5000。与高浓度的五月开始，多达50,000个细胞/毫升最初的实验，并减少技术的提高和整体细胞活力和产量提高。 到BD Biocoat层粘连蛋白细胞涂层板96孔板，使用1000个细胞 /厘米2。加湿细胞培养孵化器在37 ° C，5％的CO 2 。 24小时后，加入肝细胞生长因子（50毫微克/ NL）和表皮生长因子（20毫微克/毫升）。 对于单个细胞，分离到50μL卵圆细胞介质的细胞直接在每孔96层粘连蛋白涂层板。使用严格的选择只有一个阳性细胞的单细胞流式细胞仪设置。 24小时后，加入50μL的卵圆细胞与肝细胞生长因子和表皮生长因子媒体，在上面的步骤5.2。更改后5-7天，充分的媒体。 一旦扩大殖民地大于50％的融合，这通常会出现2周后，根据细胞总数镀细胞活力，细胞可能会被分割为1:3以下。 拆分单元格，使用胰蛋白酶0.05％的EDTA的。就足以覆盖井底，50〜100μL/孔96孔板申请。在孵化器在37 ° C时3-5分钟。 每孔100μL媒体和所有的液体转移至5 ml管。加入1 mL每管和离心5分钟，在200 XG媒体。 重新暂停在媒体层粘连蛋白涂层盘板的细胞，用细胞以及从1到3口新井（1:3）板。 6。用RT – PCR双向潜在状态的确认此过程的详细的RNeasy协议手册，该手册提供的RNeasy试剂​​盒。 使用96孔板殖民地的RNeasy微型列。从每孔吸文化传媒。直接向每孔加入75μL缓冲的RLT的RNeasy试剂​​盒。无菌橡胶警察刮盘底。 Pipettelysate到微量离心管和旋涡混合1分钟。裂解液中添加70％的乙醇混合吹打。 传输解决方案的RNeasy列放置在一个2 ml收集管中（如提供的RNeasy试剂​​盒），在微型离心机以10,000 rpm离心15秒。丢弃洗脱滤液。 再利用收集管。添加350μL缓冲液RW1（的RNeasy试剂​​盒）以10,000 rpm的RNeasy列和15秒的离心洗列膜。丢弃洗脱洗。 加入10μL的DNA酶我70μL的缓冲区的RDD（包括提供的RNeasy试剂​​盒）股票的解决方案。脱氧核糖核酸酶80μL我缓冲区的RDD孵化混合添加的RNeasy列膜在室温下15分钟的孵育。 添加350μL缓冲RW1的RNeasy试剂​​盒的RNeasy列和洗膜以10,000 rpm离心15秒。丢弃洗脱清洗和收集管。 放置在一个新的2 ml收集管中的RNeasy试剂​​盒中提供的RNeasy列。加入500μL的缓冲视网膜色素上皮的RNeasy试剂​​盒的RNeasy列和洗膜以10,000 rpm离心15秒。丢弃洗脱洗。 准备80％的乙醇，使用无RNase水的RNeasy试剂​​盒。加入500μL80％乙醇的RNeasy columnand离心机以10,000 rpm 2分钟。丢弃洗脱洗。 将全速5分钟的RNeasy列在一个新的2ml收集管（的RNeasy试剂​​盒）和离心机。丢弃任何洗脱清洗和收集管。 将在一个新的1.5 ml收集管中的RNeasy的列（的RNeasy试剂​​盒）。加入14μL无RNase水的RNeasy试剂​​盒列膜和离心1分钟全速中心。收集滤液与纯化的RNA转移到冰，如果创建的cDNA立即或存放在零下80℃，以供将来使用。 反转录使用Omniscript.Dilute核糖核酸酶抑制剂的终浓度为10单位/μL，在冰冷的1X缓冲液RT。涡为5秒，5秒的脉冲离心机。根据Omniscript协议第13页，准备上冰的一个新的主组合。涡为5秒，5秒的脉冲离心机。推荐给准备了mastermix量10％以上为所有反应所需的总要求。 包含主结构的个别管加入模板RNA。涡为5秒，5秒的脉冲离心机。 60分钟在37 ° C。 使用HotStarTaq DNA聚合酶的肝细胞（白蛋白）和胆管的特定基因的PCR扩增。准备反应HotStarTaq协议的书，每页15混合。引物浓度为20分/μL稀释股票推荐，并正向和反向引物1μL/反应管。根据最初用于RNA提取的细胞数，我们建议分3个反应管（装载控制的β-肌动蛋白 ，白蛋白，和KRT19）最终的cDNA开始。 PCR引物设计是列于表1。 放入热循环反应管。推荐下列程序进行初步的实验：95℃保温15分钟× 1周期，95 ° C为30秒，55 ° C，持续30秒，72 ° C 30秒× 35次，72℃10分钟。 使用溴化乙锭浸渍琼脂糖凝胶电泳PCR产物分析。 7。确认的CD133 +干细胞肿瘤的潜力此过程可以用新鲜分离的细胞从第4步或使用已经从第5步培养细胞。我们建议执行最初的实验中培养的细胞，如新鲜分离的细胞会减少的生存能力和降低产量。 从上面的步骤5.5使用胰蛋白酶0.05％的EDTA的Trypsinize细胞。经过3-5分钟的潜伏期在37 ° C，添加100μL的媒体，每孔和转移所有的液体，个别5毫升的管（1 = 1管）从每口井。添加1毫升媒体，每管和离心5分钟，在200 XG。 在1 mL冰冷的PBS重悬细胞。取出10μLPBS细胞悬液，加入10μL台盼蓝。利用台盼蓝拒，确定活细胞的数量。如果使用流式细胞仪分离出的细胞，细胞数量将由流式细胞仪隔离计数。 离心机在200 XG细胞5分钟，重新悬浮在PBS浓度在1 × 10 6活cells/100μL。添加100μL基质胶。六周龄免疫缺陷的裸鼠皮下注射使用28 gague针。在每个站点200μL注入1 × 10 6细胞。 小鼠每日监测肿瘤生长。一旦肿瘤形成，通常3-4周的潜伏期后，，肿瘤体积测量用游标卡尺（高x长x宽）。 8。代表性的成果： 从正常，健康的小鼠肝，预期的CD133 +肝脏干细胞的细胞产量是1000到5000每肝。这些细胞是静态肝脏中比较少见的，并不会扩大在文化。我们不建议使用单细胞分析正常肝和可行的细胞，将扩大产量极低。 对于肝脏慢性损伤显著，如饮食6周1或基因改造，造成慢性损伤，如在MAT1a DDC的0.1％， – / -或肝具体PTEN – / -小鼠，2-4 CEL预计数LS孤立的增加，与隔离高达10万细胞/肝（图2）。如果使用遗传模型，自发肿瘤率的知识是至关重要的，因为肝脏干细胞的分离这些程序应进行无瘤动物。例如，如果MAT1a – / -模型的形式在18个月的自发肿瘤，我们推荐使用动物不迟于15-16个月之前，任何报道的自发肿瘤。 从单细胞慢性损伤模型的分离，将产生几个（3-9 colonies/96孔板）殖民地，扩大了从单细胞的过程是掌握了一次，是保证细胞活力。图3从单一的CD133 +细胞扩大后7天的菌落目前代表相衬图像。 使用白蛋白和Krt19 RT – PCR技术进行双向潜在状态的确认。扩大单细胞克隆将展示既表达肝细胞标记（ 白蛋白 ）和胆管（Krt19）。图4演示了由三个独立的殖民地的双向潜在的表达，与大约25个细胞/ 7天的殖民地。 CD133 +干细胞从正常肝和化学性肝损伤（如DDC 0.1％，连续6周的饮食）不会在裸鼠体内形成肿瘤。 CD133 +从特定的遗传模型（MAT1a – / -或肝具体PTEN – / -小鼠）的干细胞在裸鼠 ​​体内形成肿瘤中晚期肿瘤的慢性损伤的阶段，如果孤立后期。这种肿瘤形成的表型是目前确定为一个癌症干细胞，例如2-4，MAT1a – / -小鼠的形式在18周龄自发性肝肿瘤。 CD133 +孤立于15-16周期间晚期肝病的慢性损伤的阶段，肝脏干细胞，将在裸鼠体内形成肿瘤。图5展示了代表双边注射1 × 10 6从单一的CD133 +肝脏干细胞的体外扩增细胞肿瘤。 基因正向引物反向引物 β-肌动蛋白 5' – TGTTACCAACTGGGACGACA – 3' 5' – GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA – 3' 白蛋白 5' – CATGCCAAATTAGTGCAGGA – 3' 5' – GCTGGGGTTGTCATCTTTGT – 3' 角蛋白19 5' – TGCTGGATGAGCTGACTCTG – 3' 5' – AATCCACCTCCACACTGACC – 3' 表1：用于RT – PCR引物设计 图1：整体方法的原理图。 图2：CD133 +高度富集CD45的枯竭非实质部分肝脏干细胞确定的控制未受伤的野生型小鼠肝演示了0.4％的CD133 +细胞内的高度富集CD45的枯竭非实质部分。在基因敲除MAT1a – / – ，这是一种慢性肝损伤模型，CD133的人口扩大了10倍或高浓缩铀的相同比例。 图3：扩大从单一的CD133 +克隆的克隆阶段对比度的图像，从单一的CD133 +细胞层粘连蛋白包被96孔板扩大的四个殖民地。 图4：双向潜在基因表达的CD133 +肝干细胞克隆扩大殖民地 ，第7天，菌落约25细胞。基因表达，表明肝细胞标记白蛋白和胆管标记 Krt19的表达，证实BI – CD133 +细胞的潜在状态。 图5：CD133 +，肝脏干细胞在裸鼠 ​​体内形成肿瘤的箭头指示肿瘤增长4个星期后，1 × 10 6的CD133 +细胞注入从MAT1a – / -模型。。 CD133 +细胞毒素引起的慢性肝损伤，如四氯化碳或0.1％DDC的饮食，不形成肿瘤。肿瘤的形成是用来识别恶性潜能，或在癌症干细胞表型的干细胞群。