Метод описан в photoactivate одной клетки, содержащие в клетках флуоресцентного белка с помощью двух-фотонного поглощения от Ti: Sapphire фемтосекундного лазерного генератора. Для судьба карте фотоактивированного клетки, иммуногистохимии используется. Эта техника может быть применена к любому типу клеток.
Возможность дифференциально маркировать отдельные клетки имеет важное значение в развитии биологии. Например, в определении того, как гемопоэтических, линий лимфатических и кровеносных сосудов возникают в развивающихся эмбрионах требуется отображение судьбы и линии отслеживания недифференцированных клеток-предшественников. Недавно фотоактивируемых белков, которые включают: 1 Eos, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 и 9 KikGR, 10 получили широкий интерес как сотовые отслеживания зондов. Спектр флуоресценции эти светочувствительные белки могут быть легко преобразованы с УФ возбуждении, позволяя популяции клеток следует отличать от соседними. Тем не менее, photoefficiency из активированного протеина может ограничить долгосрочные клетки отслеживания 11. В качестве альтернативы фотоактивируемых белков, в клетке флуоресцеина-декстран широко используется в зародыше модели систем 7, 12-14. Традиционно для флуоресцеина выпускать из клетки-декстран, УФ-возбужденныхрадиоизлучение от флуоресценции доме лампы или одного лазерного УФ-фотонов была использована, однако такие источники ограничивает пространственное разрешение фотоактивации. Здесь мы приводим протокол к судьбе карту, происхождение следа, и обнаружить одно меченых клеток. Отдельные клетки у эмбрионов вводят в клетке флуоресцеина-декстран которые фотоактивируемые с ближнего инфракрасного лазерного импульса производятся из фемтосекундного лазера титана сапфира. Этот лазер является обычным во всех двухфотонного конфокальный микроскоп, таких как META LSM 510 NLO микроскоп, используемые в настоящем документе. С биологической ткани является прозрачным для инфракрасного облучения 15, лазерные импульсы могут быть направлены глубоко внутри эмбриона без uncaging клеток выше или ниже выбранной фокальной плоскости. Таким образом, нелинейный двух-фотонного поглощения индуцируется только на геометрического фокуса выпускать из клетки флуоресцеина-декстрана в одной ячейке. Чтобы обнаружить ячейку, содержащую Uncaged флуоресцеина-декстрана, мы опишем простой протокол от 16 до иммуногистохимии быстро видеотехникативной активированных клеток. Активация и обнаружения протокола представленные в этой статье является универсальным и может быть применен к любой модели системы.
Примечание: реагенты, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице, прилагаемой в конце статьи.
Эта статья описывает универсальный метод для отображения одной судьбой ячейки на основе фотоактивации клетке флуоресцеина-декстрана. Uncaging в клетке флуоресцеина-декстрана в одиночных камерах достигается с помощью двух-фотонного поглощения от фемтосекундных лазерных Mai Tai связан с Zeiss LSM 510 META конфокальной микроскопии. Uncaged флуоресцеина-декстрана в фотоактивированного клетки быстро визуализировать с помощью простой процедуры иммуногистохимии.
В этом протоколе двухфотонного поглощения длины волны для фотоактивации клетке флуоресцеина-декстрана составляет 740 нм. Эта длина волны была экспериментально определяется photoactivating клетке флуоресцеина-декстрана вводят эмбрионов дикого типа. Длина волны лазерного возбуждения варьировалась от 600 до 800 нм, а наличие или отсутствие флуоресценции флуоресцеина после активации было качественно определен. Мы обнаружили, что 740 нм произвел сильнейший флуоресцеина сигнал после активации. В идеале, 740 нм должна работать для всехмодельных систем, однако мы рекомендуем тестирования диапазона длин волн для определения оптимального двухфотонного длины волны возбуждения для вашего образца.
В клетке флуоресцеина-декстрана вводят дикого типа эмбрионы, для каждой из двух фотонов длины волны возбуждения испытания мы также изменялась средняя мощность лазера. Для длины волны возбуждения 740 нм, средняя мощность лазера 47 МВт производства флуоресцеина сильнее сигнал на активированном области по сравнению к снижению средней мощности лазера. Высшее средней мощности лазерного не производят сильные сигналы флуоресцеина, но абляции тканей. С фемтосекундных лазерных импульсов эффективны при абляции биологической ткани 15, мы рекомендуем определения порога генерации средней мощности для фотоактивации, чтобы избежать аблации ткани.
Два-фотонного поглощения происходит в течение небольшого объема взаимодействия. Для обеспечения правильной активации в клетке флуоресцеина-декстран, клетки должны быть приведены в надлежащее внимание. В гоэлектронной выше протокола, GFP-положительных клеток были одновременно отображаемого при дневном свете, чтобы подтвердить фокус ячейки. Таким образом, белый свет приобретения в дополнение к другим каналам является целесообразным. После подтверждения фокус ячейки, наш протокол предлагает увеличение активированных клеток. Коэффициент масштабирования от 50 до 70 Предполагается, однако, эта величина зависит от размера выбранной ячейки. Увеличение масштаба изолирует активированные клетки от соседних клеток, а также ограничивает область сканирования в течение двух-фотонной активации. В идеале, область сканирования должна охватывать большую площадь ячейки.
Обнаружение одного активированных клеток требуется, чтобы фоновое окрашивание быть минимальным. В приведенном выше протоколе иммунодетекции важно, что образец их в блокирующем буфере в течение 5 до 6 часов (шаг 4,13). При разработке с NBT / BCIP, Uncaged флуоресцеина-декстран должны стать видимыми в течение 10 до 20 минут. Если фоновое окрашивание сильна, мы предлагаем больше времени блокировки и дополнительной промывки для удаления антитела (шаг 4,17).
На рисунках 1 и 2 представлены репрезентативные результаты фотоактивации и иммунодетекции. На рисунке 1, ранним 1 – 2-клетки эмбрионов на стадии дикого типа вводили в клетке флуоресцеина-декстрана. Эмбрионы были подняты до середины сомитогенеза и установлен в низкой температурой плавления агарозы в боковой ориентации. На рисунке 1 (а, б) изобразить светлое и флуоресцентные изображения эмбриона до фотоактивации. Доказательства того, что эмбрион остался Uncaged демонстрирует отсутствие флуоресценции флуоресцеина на рисунке 1 (б). Небольшая область в сомитов была активирована с длиной волны 740 нм в течение 31 секунд использовании средней мощности лазерного из 47 мВт, рисунок 1 (с; стрелка). После активации, двухфотонное uncaging флуоресцеина-декстран произошло как показано на флуоресценции от активированного области, Рисунок 1 (D; стрелка). Активация не сопровождается лазерная абляция, как сомитной ткани остаются нетронутыми, рисунок 1 (с). На рисунке 2 показаны иммунодетекции из Uncaged плавикового escein-декстрана. Небольшая область в латеральной пластинки мезодермы из 10-сомитов эмбрион фотоактивируемые с использованием тех же параметров лазера, как указано на рисунке 1. Эмбрион был поднят и обрабатывается с использованием шагов через 4,1 4,20. Стрелки на рисунке 2 находит регионе активирована, о чем свидетельствует накопление синий осадок. Только активированный расположение четко обнаружено не вмешиваясь фоне окрашивания.
Подготовка решения:
1 X PBT (1 л)
100 мл 10 X PBS
2 г BSA
10 мл 20% Tween
10 X PBS (1 л)
80 г NaCl
2 г KCl
6,1 г Na 2 HPO 4
1,9 г KH 2 PO 4
DDH 2 O до 1 л
рН до 7,3
4% параформальдегида (160 мл)
32% параформальдегид (два флаконах по 10 мл)
8 мл 20 X PBS
132 мл DDH 2 O
Антитела решение (1 образец)
5,5 мкл порошок Ацетон
40 мкл PBT
0,8 мкл LS
0,1 мкл Anti-флуоресцеина-AP антител
2% LS (360 мкл на 1 образец)
7,2 мкл 100% LS
352,8 мкл PBT
1 X Danieau СМИ (1 л) ‡
11,6 мл 5 М NaCl
700 мкл 1 М KCl
400 мкл 1 М MgSO 4
600 мкл 1 М Ca (NO 3) 2
5 мл 1 М HEPES
DDH 2 O до 1 л
рН настроить до 7,6
‡ Danieau является идеальным решением соли для выращивания эмбрионов данио рерио dechorionated. Другие средства могут использоваться, если они изотонических растворов с проPerly осмолярности (~ 300 мосм для рыбок данио)
НБТ складе (1 мл)
50 мг нитротетразол синий
0,7 мл ангидрида диметил формамида
0,3 мл DDH 2 O
BCIP складе (1 мл)
50 мг 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат
1 мл ангидрида диметил формамида
NBT / BCIP развивающихся решения
1 мл буфера AP
4,5 мкл складе НБТ
3,5 мкл складе BCIP
Ацетон порошок
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим J. Chen за предоставление в клетке флуоресцеина-декстран синтеза протокол. Это исследование было поддержано марта Dimes награду 5-FY09-78, Американская Ассоциация Сердца награду 09BGIA2090075, и NIH / NHLBI награду HL107369 R01-01 SS отдельное спасибо C. Клоссон за микроскопии помощи.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
NBT | Sigma | I8377-250mg |
BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
LSM 510 META NLO | Zeiss | |
20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |