Zebrafish의 단세포 운명 매핑
概要
사파이어 femtosecond 레이저 발진기 : 메소드는 티에서 두 광자 흡수를 사용하는 형광 단백질 갇힌를 포함하는 단일 세포를 photoactivate에 설명되어 있습니다. 운명의지도 photoactivated 세포는 immunohistochemistry가 사용됩니다. 이 기술은 모든 세포 유형에 적용할 수 있습니다.
Abstract
differentially 단일 세포를 분류하는 능력이 발달 생물학에서 중요한 의미가 있습니다. 예를 들어, 림프 및 혈액 선박 lineages은 개발 배아의 방법을 결정하는 것은 조혈 발생의 운명 매핑 및 undifferentiated 전구체 세포의 추적 혈통이 필요합니다. 최근 등이 photoactivatable 단백질 : EOS 1, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, 8 pKindling, 그리고 KikGR 9 10 셀 추적 프로브와 같은 광범위한 관심을 받았습니다. 이러한 감광성의 단백질의 형광 스펙트럼은 쉽게 세포의 인구가 인접한 것들 구분할 수 있도록, UV 여기로 변환할 수 있습니다. 그러나, 활성 단백질의 photoefficiency 11을 추적하는 장기 세포를 제한할 수 있습니다. photoactivatable 단백질의 대안으로, 갇힌 플루오레신 – dextran 널리 배아 모델 시스템 7, 12-14에 사용되었습니다. 전통적으로 우리에서 내놓다 플루오레신 – dextran, 형광 램프 집 또는 단일 광자의 UV 레이저의 UV 여기 사용되었습니다 있지만, 이러한 소스는 photoactivation의 공간적 해상도를 제한합니다. 여기 우리는 운명지도 혈통 추적 및 단일 레이블 세포를 탐지하기 위해 프로토콜을보고합니다. 플루오레신 – dextran 갇힌 주사 배아의 단일 세포는 티타늄 사파이어 femtosecond 레이저에서 생산 근처 적외선 레이저 펄스와 photoactivated 있습니다. 이 레이저는이 문서에서 사용되는 LSM 510 META NLO 현미경 같은 모든 두 개의 광자 공촛점 현미경의 전통. 생물 학적 조직에 가까운 적외선 조사 15 투명 있기 때문에 레이저 펄스는 선택한 초점 평면 위 또는 아래 세포를 uncaging하지 않고 배아 이내 깊은 초점을 맞추고 있습니다. 따라서 비선형 두 광자 흡수는 하나의 셀에 플루오레신 – dextran을 개방하다에만 초점 기하학에서 유도됩니다. uncaged 플루오레신 – dextran을 포함하고있는 세포를 감지하기 위해, 우리는 신속하게 활성화된 세포를 시각화하는 간단한 immunohistochemistry 프로토콜 16 설명합니다. 본 논문에 제시된 활성화 및 감지 프로토콜은 다목적이고 모든 모델 시스템에 적용할 수 있습니다.
참고 :이 프로토콜에 사용되는 시약은 문서의 끝부분에 추가 테이블에서 찾을 수 있습니다.
Protocol
Discussion
본 논문은 플루오레신 – dextran 갇힌의 photoactivation에 따라 단일 셀 운명 매핑을위한 다양한 방법을 설명합니다. 하나의 세포에 갇힌 플루오레신 – dextran의 Uncaging 것은 자이스 혈구 LSM 510 META 공촛점 현미경을 결합 마이 타이의 femtosecond 레이저에서 두 광자 흡수를 사용하여 이루어진다. photoactivated 세포에 Uncaged 플루오레신 – dextran은 간단한 immunohistochemistry 절차를 사용하여 빠르게 시각이다.
이 프로토콜에 갇힌 플루오레신 – dextran의 photoactivation에 대해 두 광자 흡수 파장은 740 nm의 수 있습니다. 이 파장은 실험적 갇힌 플루오레신 – dextran 주입 wildtype의 배아를 photoactivating에 의해 결정되었다. 레이저 여기 파장은 600-800 nm의에서 변화되었고, 플루오레신 형광 후 정품 인증의 존재 또는 부재가 질적으로 결정했습니다. 우리는 740 nm의가 강한 플루오레신 신호 다음 정품 인증을 생산 것으로 나타났습니다. 이상적으로, 740 nm의 모든 모델 시스템에 대한 작동해야하지만, 우리는 샘플에 대한 최적의 두 광자 여기 파장을 결정하기 위해 파장의 범위를 테스트 좋습니다.
갇힌 플루오레신 – dextran 주입 wildtype의 배아에서 각 두 광자 여기 파장에 대해 우리는 또한 평균 레이저 파워를 다양한 테스트. 740 NM의 여기 파장을 위해, 47의 평균 레이저 전원 MW 평균 레이저 파워를 낮은 비교 활성화 지역에서 강한 플루오레신 신호를 생산. 높은 평균 레이저 힘이 강한 플루오레신 신호를 생산하지만, 조직 유도 절제하지 않았다. femtosecond 레이저 펄스는 생물 학적 조직 15 탄두에 효율적 때문에, 우리는 조직 절제를 피할 수 photoactivation에 대한 임계값 평균 레이저 파워를 결정하는 것이 좋습니다.
두 광자 흡수가 작은 상호 작용 볼륨 내에 발생합니다. 플루오레신 – dextran을 갇힌의 적절한 작동을 보장하기 위해 세포는 적절한 초점에 와야한다. 위의 프로토콜, GFP 양성 세포는 동시에 세포 초점을 확인하는 하얀 빛 아래에 몇 군데 있었다. 따라서 다른 채널 이외에 흰색 라이트 인수는 것이 좋습니다. 셀 포커스를 확인 후, 우리의 프로토콜은 활성 세포를 확대 제안합니다. 50-70의 줌 계수를 제안하지만,이 값은 선택한 셀의 크기에 따라 달라집니다. 줌을 늘리면 인접한 세포에서 활성화된 세포를 분리하고, 두 광자 정품 인증에 대한 검색 영역을 제한합니다. 이상적으로, 스캔 영역은 세포의 큰 영역을 커버한다.
단일 활성 세포의 탐지 배경 얼룩이 최소한 있어야합니다. 위의 면역 프로토콜에서는이 예제가 5~6시간 (4.13 단계)에 대한 버퍼를 차단에서 차단하는 것이 중요합니다. NBT / BCIP로 개발하면 플루오레신 – dextran은 10 분에서 20 분에서 볼 수가해야 uncaged. 배경 얼룩이 강한 경우, 우리는 항체 (단계 4.17)를 제거하는 이상 차단 시간과 추가적인 세척을하는 것이 좋습니다.
그림 1과 2는 photoactivation와 면역의 대표적인 결과를 제공합니다. 그림 1, 초 1 – 2 – 세포 단계의 배아에 wildtype 플루오레신 – dextran 갇힌로 주입했다. 배아는 중간 somitogenesis에 제기와 측면 방향으로 낮은 용해 아가로 오스에 마운트되었습니다. 그림 1 (A, B)는 photoactivation 전에 brightfield 및 배아의 형광 이미지를 묘사. 배가 uncaged 남은 증거는 그림 1 (B)에 플루오레신 형광의 부재에 의해 증명됩니다. 체절 내의 작은 지역은 47 평균 레이저의 파워 MW, 그림 1 (; 화살표 C)를 사용하여 31 초에 대한 740 nm의 파장의로 활성화되었다. 플루오레신 – dextran의 포스트 – 활성화, 두 광자 uncaging는 활성화된 지역 그림 1 (; 화살표 D)에서 형광으로 표시된 발생했습니다. somitic 조직은 그대로, 그림 1 (C) 유지로 정품 인증은 레이저 절제 동반되지 않았습니다. 그림 2는 uncaged 플루오레신 – dextran의 면역을 보여줍니다. 10 체절 단계 배아의 측면 플레이트 mesoderm의 작은 지역은 그림 1에서 설명한 동일한 레이저 매개 변수를 사용하여 photoactivated되었습니다. 배아는 사육 및 4.20 단계 4.1을 사용하여 처리되었습니다. 지역 활성화 그림 2 찾습니다에게에있는 화살표대로 파란색 침전물의 축적에 의해 지적했다. 오직 활성화 위치를 명확하게 배경 얼룩을 방해하지 않고도 감지됩니다.
솔루션의 준비 :
1 X PBT (1 L)
100 ML 10 × PBS
2g BSA
10 ML 20 % 십대 초반
10 X PBS (1 L)
80g NaCl
2g KCl
6.1 g 나 2 HPO 4
1.9 g KH 2 PO 4
1 L에 ddH 2 O
7.3으로 산도
4 % Paraformaldehyde (160 ML)
32 % Paraformaldehyde (2 인용 10 ML의 튜브)
8 ML 20 X PBS
132 ML ddH 2 O
한 ML 5 M NaCl
2.5 ML 1 M MgCl 2
5 ML 1 M 트리스의 산도 9.5
250 μL 20 % 십대 초반
41.25 ML ddH 2 O
항체 용액 (1 샘플의 경우)
5.5 μL 아세톤 분말
40 μL PBT
0.8 μL LS
0.1 μL 방지 플루오레신 – AP 항체
2 % LS (1 샘플을 360 μL)
7.2 μL 100 % LS
352.8 μL PBT
1 X Danieau 미디어 (1 패) ‡
11.6 ML 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO 4
600 μL 1 M 카 (NO 3) 2
5 ML 1 M HEPES
1 L에 ddH 2 O
산도 7.6로 조정
‡ Danieau는 dechorionated zebrafish의 배아를 양육을위한 이상적인 소금 솔루션입니다. 다른 미디어가 사용될 수 있습니다, 그들이 제대로 osmolarity (zebrafish에 대한 ~ 300 mOsm)과 isotonic 솔루션입니다 제공
NBT 주식 (1 ML)
50 MG 니트로 블루 Tetrazolium
0.7 ML 디메틸 포름 아미드의 무수물
0.3 ML ddH 2 O
BCIP 주식 (1 ML)
50 MG 5 – 브로모 -4 – 클로로 -3 – 인산 인돌릴
한 ML 디메틸 포름 아미드의 무수물
NBT / BCIP 개발 솔루션
한 ML AP 버퍼
4.5 μL NBT 주식
3.5 μL BCIP 주식
아세톤 분말
- 20 성인 물고기를 선택하고 액체 질소에서 그들을 동결.
- 절구로 냉동 생선을 갈아 및 파우더에 유봉.
- 50 ML 원뿔 튜브에 생선 분말을 전송합니다.
- 100 % 아세톤으로 원뿔 튜브를 입력합니다. 소용돌이 튜브합니다.
- 10 분에 대한 최대 RPM에서 튜브를 돌린다. 뜨는 폐기하십시오.
- 펠렛에게 100 % 아세톤에있는 다른 3 번 씻어 10 분에 대한 최대 RPM에서 튜브를 돌린다. 마지막 세척으로 뜨는 분명히 나타납니다.
- 다시 펠렛에 100 % 아세톤을 추가하고 튜브는 상온에서 대기하자. 미세한 입자 현탁액에 남아있는 동안 더 밀도 입자가 해결됩니다.
- 새로운 튜브로 미세 입자를 가만히 따르다. 나누어지는 분말 별도의 튜브에 솔루션 및 -20 ° C.에 그들을 저장
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 갇힌 플루오레신 – dextran 합성 프로토콜을 제공하는 J. 첸 주셔서 감사합니다. 이 연구는 천 수상 5 FY09 – 78, 미국 심장 협회 상을 09BGIA2090075의 월 지원하고, SS에 NIH / NHLBI 수상 R01 HL107369 – 01 특수 그의 현미경 보조 C. Closson에 감사드립니다.되었다
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
参考文献
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