Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

1. 1 일 전에 시작 : 파리의 건강한 인구는 표준 culturing 프로토콜을 사용하여 유지되어야합니다 달걀 누워 개발 제 3 instar의 애벌레가 pupariation를 시작 방황 때까지 일정한 온도에서 진행하는 허용의 3~4일 후 병 또는 튜브에서 성인을 제거하십시오. 애벌레 / pupal 전환은 prepupae (0시간 번데기 형성 – APF 이후로 간주)의 형성에 의해 표시됩니다. 고정되어 pupae들은 흰색 착색에 의한 구형 pupae에서 아직 자신의 직사각형, 둥근 모양과 앞쪽에 spiracles의 돌출부에 의해 pupariation을 시작하지 않은 애벌레 구분할 수 있습니다. 당신이 필요합니다 : pupae를 수집하기 위해 페인트 브러시 culturing의 pupae에 대한 습기 챔버 : 페트리 접시는 침수 종이 타월로 줄지어 있고 pupae의 수집, 유전자형이나 섹스의 다양한 시간 포인트 표시된 필터 종이로 덮여 1X 인산이 pupae를 세척을위한 식염수 (PBS)를 버퍼 수집, culturing 및 스테이징 pupae 침수 붓을를 사용하면 부드럽게 문화 병 / 유리병에서 0hr APF pupae를 제거하고 습기 챔버의 뚜껑에 배치합니다. 화필 및 1X PBS를 사용하면 부드럽게 번데기 케이스에서 파편을 제거하는 pupae을 씻어 필요한 정렬 섹스 pupae 경우. pupae의 생식선 primordia는 남녀를 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 남성 생식선의 primordia 쉽게 약 삼분의이 본문 5 길이 아래 pupal 표피를 통해 본 반투명 디스크 측면 쌍의 수 있습니다. 여성 생식선의 primordia 작은되며 쉽게 식별하지 않습니다. 습한 챔버에 적절하게 표시된 위치에 pupae을 놓고 일정 온도로 돌아갑니다. 적절한 발달 시점에 문화. 2. 주 2 : 해부, 고정 및 기본 항체 인큐베이션 전에 시작 : 당신이 필요합니다 : 해부의 stereomicroscope 외과 포셉 11 번 블레이드로 외과 메스 두 아홉 잘 유리 우울증 요리 (코닝 제품 # 7220-85) 1X PBS 한 접시의 우물을 채우기 : 이것은 해부 pupae 청소 rinsing 요리 고정 버퍼와 두번째 접시의 우물을 작성 항체 보육에 대한 습기 챔버. 우리는 침수 종이 타올로 늘어선 플라스틱 sealable 샌드위치 상자를 사용합니다. 고정 버퍼 : 1X PBS, 4 % paraformaldehyde, 0.2 % deoxycholic 산성 (permeabilization에 대한) 해부 플랫폼 : 한쪽으로 준수 양면 테이프 조각 맑은 현미경 슬라이드 1X PBS p100 또는 p200 pipettor 해부 포셉을 사용하면 부드럽게 한 번에 pupae 하나를 제거하고 테이프의 광범위한 너비를 직면하고있는 pupae의 앞쪽에 끝이 해부 플랫폼에서 그들을 놓으십시오. pupae이 지나치게 서부 유럽 표준시있다면, 먼저 그들을 종이 타월을 사용하여 건조 얼룩. pupae 완전히 테이프 준수 전에 그들을 위치로 붓을을 사용합니다. 공기 건조에 pupae 허용하고 테이프 (5-10 분)을 준수 수술 메스 양자 각 pupae을 해부하다. 이것은 가장 앞쪽에에서 pupae의 뒷부분 끝까지 하나의 신속한 상처로 수행됩니다. 정상적으로 완료하면, 상처는 앞쪽에 및 사후 모두 spiracles 쌍을 이등분합니다. 세정 빠르게 조직 proteolytic 손상을 방지하기 위해 필요한 샘플을 청소로 한 번에 10 개 이상 pupae을 해부하다. 붓을 사용하여 테이프에서 그들을 느슨하게 각 해부 pupae에 1X PBS의 작은 금액을 전송합니다. 청소, 고정 및 기본 항체 인큐베이션 외과 포셉 한 쌍이 anteriorly 개별 번데기의 절반을 파악하고 즉시 rinsing 요리의 잘에 젖어 함께. 해부 플랫폼은 현미경 무대에 rinsing 음식으로 대체해야합니다. 처리가 완료되고 샘플 장착을위한 준비가 될 때까지 pupae 케​​이스는 표본에 남아 있어야합니다. 아직 붙잡는 동안 번데기의 절반 부드럽게 복부의 내부 조직을 떠나 씻어 pipettor을 사용합니다. 세척하는 동안 너무 많은 압력이 상피 세포의 손실로 이어질 수 있습니다. 즉시 상온에서 고정 버퍼에 깨끗한 번데기의 절반을 전송 마찬가지로 남아있는 번데기의 절반을 처리합니다. 연습, 해부 20 번데기의 반쪽의 세척은 5 분도 채 안 걸릴한다로. pupae 1 (하나) 시간 실온에서 고정 버퍼에 품어 수 있습니다. 1X PBS에서 수정 pupae 배 오분을 씻어 샘플은 즉시 immunohistochemistry를 위해 처리될 수 있습니다 또는 최대 3 개월까지 셀 또는 에피토프 반응의 손실없이 -20 ° C에서 100 % 에탄올에 저장되어있을 수 있습니다. 샘플을 저장하려면, 희석을 통해 샘플을 평형PBS의 시리즈 : 전 100 % EtOH로 전송하기 위해 각 희석에 20 분 실온에서 EtOH (3시 1분, 1시 1분, 1시 3분). 샘플 immunohistochemistry에 대한 처리하기 전에 반대 시리즈를 통해 PBS에 다시 equilibrated해야합니다. 차 항체를 추가하기 전에 1 (하나) 시간 1X PBS (2 % 소 혈청 알부민과 보충)에서 샘플을 차단합니다. 4 박 이상의 1X PBS 적절한 농도로 희석 차 항체 ° 락을하지 않고도 C와 부화. 3. 3 일 : 보조 항체 보육, 장착 및 이미징 전에 시작 : 당신이 필요합니다 : 두 외과 포셉 마운트 미디어 (글리세롤, Vectashield [벡터 연구소] 또는 Slowfade 골드 [Invitrogen]) 우울증 잘 현미경 슬라이드 (0.8 ㎜) Coverslips (24 X 40mm) 차 항체 보육 및 장착 : 샘플에게 배 십분 1X PBS로 각각 씻으십시오 이차 항체를 추가하기 전에 1 (하나) 시간 1X PBS (2 % 소 혈청 알부민과 보충)에서 샘플을 차단합니다. 3 (세) 시간 락을없이 어둠 속에서 실온에서 1X PBS 적절한 농도로 희석 차 항체와 부화. 샘플에게 배 십분 1X PBS로 각각 씻으십시오 적절한 경우, counterstain pupae (우리는 DAPI로 핵을 얼룩 예제 [4 ', 6 diamidino – 2 – phenylindole] 10 분 동안 PBS에 희석). 장착하기 전에 적절한 미디어에 샘플을 (30 분 최소) 평형. 샘플 슬라이드를 준비합니다. pupae의 형태 플랫 장착을 방지합니다. 샘플은 이미지에 대한 우울증 슬라이드 (드롭 슬라이드)의 우물에 탑재하고 있습니다. 장소 잘 우울증에 장착 미디어 75 100ul. 여러 샘플은 단일 슬라이드에 장착할 수 있습니다. 번데기의 경우는 설치하기 전에 샘플에서 제거되어야합니다. anteriorly 내부 pupal 멤브레인 파악하지 않도록하는 개인 번데기 케이스를 파악. 포셉의 두 번째 쌍의로 부드럽게 머리에 의해 내부 pupal 멤브레인을 파악하고 pupal 케이스에서 제거합니다. 즉시 잘 우울증에 샘플을 전송 및 추가 샘플 처리를 계속합니다. 우울증에 잘 측면 표면이 위로 향하게와 샘플 균일 프로브 또는 포셉 위치를 사용합니다. 가끔 공기 방울은 프로브와 함께 제거할 수 있습니다. 부드럽게 공기 방울을 소개 않도록주의하면서 시료로 coverslip을 낮출 4. 대표 결과 : 샘플이 프로토콜은 성인 복부의 매출 형태를 유지를 사용하여 준비 하였다. 이미지 스택은 복부 토폴로지를 조사하기 위해 적용될 수 2 차원 이미지를 3 – D 렌더링을 생성할 것으로 예상됩니다. 그림 1. Drosophila pupae의 세그먼트 유전자 제품 날지 못하는 단백질과 Engrailed 표현 (EN – gal4 : uas – GFP)은. : 및 안티 GFP 마우스 방지 WG (아이오와 하이 브리 도마 은행 4D4)와 번데기 형성 후 26시간 (APF)에 시각되었습니다. 10X 배율은 앞쪽에 남아 있으며, 지느러미가있다. Nucleii는 DAPI로 counterstained되었습니다. 약 50 이미지 (슬라이스 사이 ΔZ는 2.5μm이다)의 스택은 예상했다.