Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

1. Tag 1 Bevor Sie beginnen: Eine gesunde Bevölkerung von Fliegen sollte beibehalten unter Verwendung von Standard-Protokollen Kultivierung werden: remove Erwachsene aus Flaschen oder Ampullen nach 3-4 Tagen von Ei-legen und damit die Entwicklung auf eine konstante Temperatur bis wandernde 3 rd Larvenstadium initiieren pupariation gehen. Die Larven / Puppen Übergang wird durch die Bildung der prepupae (als 0 Stunden nach Puparium Bildung-APF) markiert. Immobile Puppen sind aus älteren Puppen durch ihre weiße Färbung und von Larven, die noch nicht pupariation durch ihre längliche, runde Form und Vorwölbung der vorderen Stigmen begonnen unterschieden. Sie benötigen: Ein Pinsel für das Sammeln Puppen Eine feuchte Kammer zur Kultivierung von Puppen: Eine Petrischale mit benetzt Papiertuch ausgekleidet und mit Filterpapier für die verschiedenen Zeitpunkte der Erhebung, Genotyp und Geschlecht der Puppen markiert 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen Puppen Sammlung, Kultivierung und Inszenierung Puppen Mit einem benetzten Pinsel entfernen sanft 0HR APF Puppen aus der Kultur-Flaschen / Vials und legen Sie sie in den Deckel der feuchten Kammer. Mit dem Pinsel und 1X PBS vorsichtig waschen die Puppen, um Schmutz aus der Puppe Fall entfernen Gegebenenfalls Art der Puppen nach Geschlecht. Die Gonade Primordien der Puppen können verwendet werden, um den Geschlechtern zu sortieren. Die männlichen Keimdrüsen Primordien sind eine seitliche Paar transluzenten Scheiben leicht durch die Puppenstadium Nagelhaut ca. 2 / 3 über die gesamte Länge des Körpers 5 zu sehen. Die weibliche Gonade Primordien sind kleiner und nicht so leicht zu erkennen. Legen Sie die Puppen in die entsprechend gekennzeichneten Position in der feuchten Kammer und zurück auf eine konstante Temperatur. Kultur an den entsprechenden Entwicklungs-Zeitpunkt. 2. Tag 2: Dissection, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation Bevor Sie beginnen: Sie benötigen: Dissection Stereomikroskop Chirurgische Pinzette Chirurgische Skalpell mit der Nummer 11 Klingen Zwei neun und Glas Depression Gerichte (Corning Produkt # 7220-85) Fill Brunnen von einem Gericht mit 1X PBS: Dies ist die Spülung Gericht zur Reinigung zerlegt Puppen Fill Bohrungen der zweiten Schale mit Fixierung Puffer Feuchten Kammer für die Antikörper-Inkubation. Wir verwenden Kunststoff verschließbaren Sandwich-Boxen mit benetzt Papierhandtücher ausgekleidet. Fixation Puffer: 1x PBS, 4% Paraformaldehyd, 0,2% Desoxycholsäure (zur Permeabilisierung) Dissection Plattform: Clear Objektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband verklebt auf einer Seite 1X PBS p100 oder p200 Pipette Zergliederung Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Puppen eine nach der anderen und sie auf die Zerlegung Plattform mit dem vorderen Ende der Puppen mit Blick auf den breitesten Breite des Bandes. Wenn Puppen übermäßig nass sind, zuerst blot sie trocken mit einem Papiertuch. Bevor die Puppen ganz auf das Band geklebt haben, verwenden Sie einen Pinsel zu positionieren. Lassen Sie die Puppen an der Luft trocknen und halten, um das Band (5-10 Minuten) Mit dem chirurgischen Skalpell sezieren jeden Puppen bilateral. Dies geschieht am besten mit einer einzigen schnellen Schnitt von der vorderen bis zum hinteren Ende der Puppen erreicht. Wenn richtig gemacht, wird der Schnitt halbieren beiden vorderen und hinteren Luftlöcher Paaren. Dissect nicht mehr als 10 Puppen in einer Zeit, als Wasch-und Reinigungsmitteln die Proben schnell ist notwendig, um proteolytische Schädigung des Gewebes zu verhindern. Mit einem Pinsel, Übertragung einer kleinen Menge 1X PBS in jedes seziert Puppen, um sie von dem Band zu lösen. Reinigung, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation Mit einem Paar chirurgische Pinzette fassen eine individuelle Puppe ein halb nach vorn und sofort eintauchen in eine Vertiefung der Spül-Schüssel. Die Dissektion Plattform soll durch die Spülung Schüssel auf dem Mikroskoptisch ersetzt werden. Die Puppen Fall sollte auf die Probe belassen werden, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist und die Proben sind bereit zur Montage. Während noch Ergreifen der Puppe die Hälfte verwendet eines Pipettierautomaten vorsichtig abwaschen das innere Gewebe des Bauches. Zu viel Druck beim Waschen kann zum Verlust von Epithelzellen führen. Sofortüberweisung das saubere Puppe Hälfte Fixierung Puffer bei Raumtemperatur und Verfahren die restlichen Puppe Hälften ähnlich. Mit ein wenig Übung, Dissektion und Waschen von 20 Puppe Hälften sollte weniger als 5 Minuten. Lassen Sie Puppen in Fixierung Puffer bei Raumtemperatur inkubieren für 1 (eine) Stunde. Spülen festen Puppen 3x 5 Minuten in 1X PBS Die Proben können sofort für die Immunhistochemie verarbeitet werden oder in 100% Ethanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu 3 Monaten ohne Verlust von Zellen oder Epitop Reaktivität. Zum Speichern von Proben, äquilibrieren Proben durch eine VerdünnungSerie von PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) bei Raumtemperatur für 20 Minuten in jeder Verdünnung vor der Übertragung zu 100% EtOH. Proben müssen erneut in PBS äquilibriert durch die Reverse-Serie vor der Verarbeitung für die Immunhistochemie. Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des primären Antikörpers. Inkubieren mit dem primären Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS über Nacht bei 4 ° C, ohne Schaukeln. 3. Tag 3: Sekundäre Antikörper-Inkubation, Montage-und Imaging- Bevor Sie beginnen: Sie benötigen: Zwei chirurgische Zange Montage Medien (Glycerin, Vectashield [Vector Labs] oder Slowfade Gold [Invitrogen]) Depression und Objektträger (0,8 mm) Deckgläser (24 x 40 mm) Sekundäre Antikörper-Inkubation und Montage: Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des sekundären Antikörpers. Inkubieren mit sekundärem Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln, ohne Schaukeln für 3 (drei) Stunden. Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS Gegebenenfalls Gegenfärbung Puppen (Beispiel haben wir Flecken Kerne mit DAPI [4 ',6-Diamino-2-phenylindole] in PBS für 10 Minuten verdünnt). Äquilibrieren Proben (mindestens 30 Minuten) in geeigneten Medien vor der Montage. Bereiten Sie eine Probe gleiten. Die Morphologie der Puppen verhindert flache Montage. Die Proben werden in die Vertiefung einer Depression slide (tropfen) für die Bildgebung montiert. Legen Sie 75-100 ul der Montage Medien in die Depression gut. Mehrere Proben können auf einer einzelnen Folie angebracht werden. Die Puppe Fall muss aus den Proben vor der Montage entfernt werden. Fassen Sie eine individuelle Puppe Fall anterior Dabei bitte nicht auf den internen Puppenstadium Membran zu erfassen. Mit einer zweiten Pinzette vorsichtig greifen die internen Puppenstadium Membran durch den Kopf und entfernen Sie sie aus der Puppenhülle. Unmittelbar Übertragung der Probe auf die Depression gut und die Verarbeitung fortzusetzen zusätzliche Proben. Mit einer Sonde oder Pinzette Position der Proben gleichmäßig in die Depression auch mit den seitlichen Oberfläche nach oben zeigt. Gelegentliche Luftblasen können mit einer Sonde entfernt werden. Senken Sie das Deckglas auf den Proben dabei nicht um Luftblasen zu präsentieren 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Proben unter Verwendung dieses Protokoll erhalten die grobe Morphologie der erwachsenen Bauch. Bild Stapel können projiziert, um eine zweidimensionale Bild-oder 3-D Rendering angewendet werden, um Bauch-Topologie untersuchen zu generieren. Abbildung 1. Segmentation Genprodukte in Drosophila Puppen Wingless Protein und Engrailed Ausdruck (En-Gal4: UAS-GFP). Wurden 26 Stunden nach Puparium Bildung (APF) visualisiert mit Maus anti-Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) und anti-GFP. 10-facher Vergrößerung ist vorderen linken und dorsal wird. Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Stacks von ca. 50 Bilder (DELTA Z zwischen den Schichten ist 2.5μm) projiziert wurden.