La endocitosis en vivo de hígado seguido por la purificación de las células hepáticas de la perfusión del hígado

1. Extirpación del hígado (adoptado de PO Seglen 12 y R. Blomhoff 13 con modificaciones 14,15) Añadir 10 ml de 30% de isoflurano en polietilenglicol a una placa de Petri en una cámara de 5,5 L cerrada. Lo mejor es esperar 10-15 minutos después de la adición de isoflurano para crear un ambiente estabilizado dentro de la cámara. Lugar a una rata en la cámara sellada y permitir que se convierta anestesiados. Pleno efecto de la anestesia son evidentes cuando el animal se queda sin fuerzas, que no responde, y presenta una respiración profunda. Coloque 2 mL de isoflurano en polietilenglicol en unas bolas de algodón en la parte inferior de un tubo de la jeringa de 30 ml. Coloque el ratón sobre su espalda en una bandeja cubierta de pañal y se coloca el tubo de la jeringa sobre el hocico. Inmediatamente confirmar anestesia profunda mojando el abdomen con un 70% de etanol. No deje que el animal muere por sobredosis de isoflurano. El uso de tijeras y pinzas venda, exponga toda la abdcavidad NOMINAL. Localizar la vena porta y, con las pinzas, sacar dos hilos de seda o hilo de poliéster quirúrgica (ligadura) por debajo de la vena porta inmediatamente encima de la rama mesentérica. Retirar las pinzas y corbata un nudo suelto. El uso de pinzas por debajo de la vena porta y tirando suavemente de vuelta a enderezar la vena, canular la vena con un catéter AutoGuard Insyte (18 GA, 1.3 x 300 mm, BD Biosciences), catéter o similar. El catéter debe ir más allá de varios mm el bucle formado por el hilo. Retractarse y retirar la aguja se suelta el gatillo con resorte en el catéter. Sangre deberá empezar a filtrarse a través del catéter que indica la colocación correcta de ligadura. Apretar el nudo simple y segura con otro nudo. Sever o la vena cava inferior o la aorta descendente (aorta abdominalis) para permitir que la sangre fluya en el sistema circulatorio. Comience a enjuagar el hígado con oxigenadaTBS a 37 ° C para eliminar la sangre (blanqueo), con un caudal de 20 mL / min. El hígado se convierta de un color púrpura rojizo a un color arcilla. Mientras que el hígado está descargando, extirpar el hígado a través de cortar el tubo digestivo y el tejido conectivo. Es importante no lacerar el hígado o el pinchazo de la cápsula de Glisson. Lugar en el hígado en una red de plástico sobre un embudo que permite a los topes que se recojan y recircula. Buffers en este punto no debe ser recirculado, pero el flujo en el vaso de residuos. Lavado no debe durar más de 10 min. (Fig. 2A). Prepare la solución requiere endocitosis en 2,1 paso. 2. La internalización de 125 I-SA-b-Hep (u otro ligando adecuado etiquetado) A 50 ml medio RPMI en un vaso pequeño, se suman a una concentración final de BSA al 0,05% y 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep o ligando otros debidamente etiquetados para la endocitosis. Adjunte este vaso a la Apparatus para permitir la oxigenación. Apague la bomba, cambiar la tubería de entrada, y luego pasar a la bomba a 20 ml / min. Como el RPMI etiquetado se aproxima a la del hígado, apague la bomba y permita que el exceso de líquido en el embudo y drenar la tubería. Coloque el tubo de drenaje en el vaso de los medios de comunicación que permita la recirculación de los medios de comunicación la etiqueta y luego reiniciar la bomba. Permitir que los líquidos para recircular a través del hígado por no más de 1 hora. Durante esta etapa, la internalización, asegúrese que la temperatura en el hígado es estable por lo cubre y preparar la colagenasa para la digestión. 3. La digestión del hígado por la digestión con colagenasa Recién disuelto y se filtra (0,45 m) colagenasa (100 mg / kg de peso del animal) debe ser añadido al buffer 2 en un volumen total que no exceda de 60 ml a 37 ° C. El volumen depende de la longitud / volumen interno de la tubería y debe ajustarse en consecuencia. Parar la bomba y el intercambioTubo de entrada del vaso medios de comunicación a la TBS. Lavar el hígado durante 2 min a 50 ml / min que permite el aflojamiento de la unión entre las células que se desmosómicas dependiente de calcio. Mientras que el hígado es el lavado, cambio de la copa de los medios de comunicación con el frasco que contiene colagenasa en el aparato. Inmediatamente después del lavado, comienza la digestión con colagenasa en un bucle de circulación a una velocidad de flujo de 20 mL / min durante 15 min. Desde lotes colagenasa varían según el número de lote, las variaciones en la cantidad y el tiempo de la digestión deben ser optimizados para cada nuevo lote de colagenasa. La colagenasa es también dependiente de calcio. Apague la bomba y el interruptor de la memoria intermedia y las líneas de gas de A a B. Frasco Frasco de transferencia de la línea de efluentes del contenedor de desechos de frasco B (Fig. 2B). Parar la bomba, retirar el catéter y la transferencia del hígado a un plato que contiene 20 a 30 ml de tampón 1. Pele la cápsula de Glisson del hígado y del movimiento de la células en el líquido. A medida que el líquido se vuelve opaco con material celular, transferir las células a través de una malla de 100 micras seguido de una filtración a través de una malla de 30 micras y luego en un Erlenmeyer de 50 ml en hielo. Añadir más Tampón 1 en el hígado y continuar agitando las células de la matriz del hígado, la transferencia de los líquidos a los filtros de malla y cónicos. Repita los pasos 3,7 hasta 3,9 hasta que no haya más células pueden desprenderse con agitación razonable del hígado. 4. Hepatocitos y purificación de la SEC Centrífuga de 50 ml que contiene conicals células a 150 g durante 3 min. para que sedimenten los hepatocitos. Transferencia de la fracción de líquido que contiene células no parenquimatosas a un nuevo 50 conicals ml en hielo. Lavar los hepatocitos se resuspender el pellet en tampón 3 y repitiendo los pasos 4.1 y 4.2 veces más de tres. Al final de los lavados, los pellets son ≥ 97% pura hepatocitos. Para obtener la SECS, centrífuga de todos los tubos de containing agrupados sobrenadante (que contiene HSCs, SECS, y KCS y algunos hepatocitos pequeños) a 200 g durante 10 min. a 4 ° C. Aspirar el buffer y resuspender todas las bolas en 5 ml de RPMI / BSA a 4 ° C. Piscina de las células, junto a dos tubos y añadir RPMI / BSA, hasta un volumen de 35 ml. Se centrifuga la conicals a 100 g durante 3 min. Recoge los 25 ml de líquido y la transferencia a un lugar limpio cónico de 50 ml. Resuspender el precipitado en los medios de comunicación ml restantes 10 y volver a agregar 25 ml de RPMI frío / BSA y centrifugar a 100 g durante 3 min. Repita los pasos 3.8 y 3.9, una vez más, desechar el sedimento celular y los medios de comunicación inferior a 10 ml. Se centrifuga la supernatents de pellet SECS, KC, y HSCs a 200 g durante 10 min. a 4 ° C. Prepare tres tubos de 50 ml que contiene 20 ml de Percoll al 25% en PBS en hielo. Subcapa con 15 ml de Percoll al 50% en cada tubo. Resuspender los pellets de células en un volumen total de 30 ml de RPMI / BSA. Cuidadosamente superposición each gradiente con 10 ml de células y se centrifuga a 900 g durante 20 min a 4 ° C. SECS y KCS tiene muy cerca de la densidad de flotación y se encuentran en la interfaz de un 25/50%. HSCs son típicamente menos del 25% / interfaz de medios debido a su flotabilidad mayor medida que las células lípidos de almacenamiento. Cualquier resto de los hepatocitos y las células sanguíneas tienen la buoyancies inferior y se precipitan. Aspirar de arriba hacia abajo cerca de la interfaz de un 25/50% y desechar este material. Recoger las células de la interfaz de un 25/50% y la transferencia a un nuevo cono de frío RPMI. El volumen final debe ser ~ 40 ml para diluir el Percoll. Se centrifuga la cónica a 350 g durante 10 min a 4 ° C para que sedimenten las células. Resuspender las células en el ~ 10 ml previamente calentada RPMI que contiene 100 U / mL Penicillin/100 g / ml estreptomicina células y colocar en un lavado con ácido de cristal placa de Petri o Cristalizador. Se incuban las células durante 15 minutos. a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos. Roca o agitar la placa un pocoy luego recoger los segundos en el sobrenadante. El KC se adhieren al cristal mucho más rápidamente que la SECS. Por otra parte, SECS puede ser separado de KC por inmunopurificación el uso de anticuerpos anti-CD31 o anti-Stabilin2/HARE conjugada con partículas magnéticas. Números de la viabilidad celular y puede ser evaluada por exclusión del azul tripano usando un hemocitómetro o con el uso de un contador celular automático. La cultura de la SECS en fibronectina recubiertos platos de plástico a 37 ° C, 5% de CO 2, RPMI/0.25% BSA con 40 ng / mL de VEGF, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina o con medio condicionado de hepatocitos. Hepatocitos, KC, y SECS puede evaluar para la internalización de material marcado por el uso de un contador gamma y la normalización de la proteína celular total o por microscopía (si la etiqueta fluorescente) utilizando estos métodos de cultivo. 5. Los resultados representativos: Purificación de hepatocitos es ≥ 97% y purificación SEC es Typicaliado de ≥ 95% con este método. La escisión de la cavidad abdominal, la canalización de la vena porta y palidez del hígado todos debe ocurrir dentro de un minuto para obtener mejores resultados. HARE/Stabilin-2 es un receptor específico en la SECS hígado y no se expresa en otros tipos de células del hígado. En esta muestra, lisados ​​celulares de ambos hepatocitos y SECS fueron separados en un 5% SDS-PAGE y probaron con un anticuerpo monoclonal contra las dos isoformas de Stabilin-2 (Fig. 3). La heparina no fraccionada se inyecta en el torrente sanguíneo se elimina por el hígado 16. El aclaramiento se realiza principalmente por la SECS hígado a diferencia de los hepatocitos y KC 17. El receptor Stabilin-2/HARE es el receptor principal de depuración que se une a la heparina e internaliza en las secciones 18. En nuestro ejemplo, hemos denominado heparina con una etiqueta de biotina en el grupo carboxilato de GlcNAc / NS. La biotina se conjugó con estreptavidina yodado para la detección de prot heparina internalizadoeoglycan. La inyección de la heparina etiqueta seguido por exanguinación 30 minutos después de la inyección nos permite controlar que los órganos interiorizar esta forma de heparina. En este corto intervalo de tiempo, el hígado es el órgano tolerancia primaria (Fig. 4). Para entender más claramente qué tipo de célula es responsable del despacho, hemos añadido 125 I-SA-b-Hep a los medios de comunicación RPMI suplementado con BSA al 0,05% y se deja que circule a través del hígado durante 20 minutos. Después de la digestión de colagenasa y la purificación celular, la gran mayoría de heparina marcada es internalizado por segundos en contraste con los hepatocitos (Fig. 5). Figura 1. Arquitectura básica del hígado. SECS forman las paredes de los sinusoides y normalmente son fenestrados (pequeños grupos de círculos). Las células estrelladas (HSC) se encuentran en el espacio de Disse, en contraste con Kupffer canas (KCS), que normalmente están presentes en la microvasculatura de los sinusoides. Hepatocitos ocupan el otro lado del espacio de Disse. Figura 2. Esquema del aparato de perfusión. A) Puesta en marcha del aparato durante el lavado / lavado de los sinusoides del hígado. TBS es en un frasco de 1 litro. B) Un frasco de 125 ml que contenga aproximadamente 60 ml de tampón 2 con colagenasa se utiliza para la digestión del hígado en un circuito cerrado. La línea de aguas residuales también se puede cambiar el contenedor de residuos para el frasco B a través de una muesca en el tapón de goma. La línea de oxígeno no se sumerge en el tampón que contiene colagenasa (frasco B) para evitar la formación de espuma. Los tapones en cada frasco se hacen muescas para permitir una transferencia eficiente de la línea de efluentes y para evitar aumento de la presión del gas de oxígeno. Figura 3. </spreparaciones trong> hepatocitos no están contaminados con SECS. Igual cantidad de lisados ​​celulares de los lotes purificados de los hepatocitos (carril 1) y segundos (carril 2), fueron separados en un 5% SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa. Anticuerpo monoclonal # 30, que es específica contra las dos isoformas (315 kDa y 190) de HARE/Stabilin-2 fue utilizado para investigar los lisados. Figura 4. Distribución de la heparina en los órganos de la etiqueta. Las ratas fueron inyectadas a través de la vena lateral de la cola con 125 I-SA-b-hep esperar 30 minutos y se desangraron entonces. La sangre fue recolectada a fin de no dar a alguno de los órganos artificialmente altas lecturas. Cuentas por minuto (CPM) de cada órgano se normalizaron en contra el peso de los órganos en gramos. Figura 5. Cantidad de heparina etiquetados en los hepatocitos y SECS. RPMYo los medios de comunicación que contiene 125 I-SA-b-Hep se permite la circulación a través de un hígado intacto durante 20 minutos seguido por la digestión de colagenasa y la purificación celular. Igual cantidad de lisados ​​de los hepatocitos y SEC proteína celular se cuantificó con el ensayo de Bradford y contados por un contador gamma. Figura 6. Las células de Kupffer son separados de SECS por adhesión sobre el vidrio. Las células se colocan en un recipiente de vidrio lavado con ácido y la cristalización permite que se adhieran durante 15 min a 37 ° C, 5% de CO 2. El sobrenadante que contiene las células no adheridas fue agitado vigorosamente y se coloca en un tubo de centrífuga. Lisados ​​de células adheridas, tanto en el vidrio (carril 1) y de células no adheridas (carril 2), fueron separados en un 8% SDS-PAGE, se transfirieron, y probaron con un anticuerpo contra el CD163 que es específica para las células de Kupffer. SECS la figura 7. Chapada en fibronectina recubiertos de plástico de 6 pocillos se incubaron durante la noche en medio RPMI suplementado con 0,1% de BSA. Imágenes de contraste de fase se tomaron en (A) 100x y (B) aumento de 200x.