肝灌流による肝細胞の精製した生体肝エンドサイトーシスに

1。肝臓の切除（修正14,15とPO Seglen 12とR. Blomhoff 13から採用された） クローズ5.5 Lチャンバー内のペトリ皿にポリエチレングリコールのイソフルラン10mLの30％を追加。それは、チャンバー内で安定な雰囲気を作成するにはイソフルランの添加後10〜15分を待つことが最適です。 密閉チャンバーにラットを置き、それが麻酔になることができます。麻酔の完全な効果は、動物がぐったりなったときに、応答のない明白であり、そして深呼吸を示す。 30mLの注射器のチューブの下部にある綿球のポリエチレングリコールのイソフルランの場所を2mL。 おむつに覆われたトレイに、その背中にラットを置き、鼻を介して注射器のチューブを置きます。 直ちに70％エタノールで腹部を濡らすことによって、深い麻酔を確認してください。動物はイソフルラン過剰摂取で死ぬようにしてください。 包帯のはさみや鉗子を使用して、全体のABDを公開ominal空洞。 静脈ポルタを検索して、鉗子を使用して、すぐに腸間膜枝の上に静脈ポルタ下外科シルクやポリエステル糸（合字）の二本鎖を引く。 鉗子を撤回し、緩い結び目の結び目を作る。 静脈ポルタの下に鉗子を使用して、ゆっくりと静脈をまっすぐに引いて、Insyte Autoguardのカテーテル（18 GA、1.3 × 300ミリメートル、BDバイオサイエンス）または同様のカテーテルを静脈にカニューレを挿入する。カテーテルは、スレッドによって形成されるループを超えて数mmを行く必要があります。 カテーテルにあるバネトリガーを解放することによって針を収納して削除する。血液は、適切な合字の配置を示すカテーテルにまで浸透開始する必要があります。 オーバーハンドノットを締め、別のオーバーハンドノットで固定します。 血液が循環系から排出できるように、どちらかの下大静脈や下行大動脈（腹部大動脈）を断ち切る。 酸素と肝臓のフラッシュを開始する37 TBS℃で20 mL /分の流量で血液（白化）を除去する。肝臓は赤紫色からローム層の色に変わるはずです。 肝臓がフラッシュされている間、消費税消化管と結合組織を離れて切断することによって肝臓。肝臓または穿刺グリソン鞘を裂くようにすることが重要です。 バッファの収集と再循環を可能にする漏斗上にプラスチックのネット上で肝臓を置きます。この時点でバッファは循環が、廃棄物のビーカー内に流入してはいけません。フラッシングは、10分以上続くことはありません。 （ 図2A）。ステップ2.1で必要なエンドサイトーシスの溶液を調製します。 2。 125 I – SA – B – HEP（または他の適切な標識リガンド）の内在化小さ ​​なビーカーに50mlのRPMI培地に、最終濃度0.05％のBSAと0.01 mCiの125 I – SA – B – HEPまたはエンドサイトーシスのための他の適切な標識リガンドに追加します。 apparatuにこのビーカーを取り付けますの酸素化を可能にする。 、ポンプの電源をオフにインレットチューブを切り替え、その後、20mL /分でポンプの電源を入れます。 というラベルのRPMIが肝臓に近づくと、ポンプの電源を切り、漏斗とチューブドレインで余分な水分を許可する。 ラベルを付けたメディアの再循環を可能にしてポンプを再起動するためにメディアのビーカーにドレインチューブを置きます。 流体がこれ以上より1時間肝臓を通して循環することができます。 この内部化のステップの間、肝臓内の温度がそれをカバーし、消化のためにコラゲナーゼを準備することで安定であることを確認してください。 3。コラゲナーゼ消化により肝臓の消化たて溶解し、ろ過（0.45μm）のコラゲナーゼ（100 mg / kgのラットの体重）を37で60 mLを超えないように総量で2をバッファに追加されるべき℃にボリュームは、チューブの長さ/内部容積に依存しており、それに応じて調整する必要があります。 ポンプと交換停止メディアのビーカーからTBSへの入口チューブ。 カルシウム依存しているdesmosomal細胞の接合部のゆるみを可能に50mL /分で2分間の肝臓をフラッシュします。 肝臓がフラッシュされている間、装置のコラゲナーゼを含むビーカーにメディアのビーカーを交換。 すぐに洗浄後、15分間20mL /分の流量で循環ループにおけるコラゲナーゼで消化を始めます。コラゲナーゼのバッチは、ロット番号によって異なりますので、消化の量と時間の変動は、コラゲナーゼのすべての新しいロットのために最適化する必要があります。コラゲナーゼはまた、カルシウム依存性である。ポンプの電源をオフにして、フラスコBに（ 図2B）フラスコBに廃棄物の容器からの流出ラインを転送フラスコからバッファおよびガスラインを切り替える。 ポンプを停止し、カテーテルを取り外し、20〜30 mlのBuffer 1を含む皿に肝臓を転送する。 肝臓のグリソン鞘戻って皮をむき、細胞を振る液体での出。 液体が細胞物質と不透明になると、30μmのメッシュを介して、次に50 mLコニカルに氷上でろ過により、100μmのメッシュを介して細胞を移す。 肝臓に多くのバッファ1を追加し、メッシュフィルターと円錐に液体を移す、肝臓のマトリックスから細胞を振り続ける。 これ以上の細胞が肝臓の揺れ合理的に外れないことができるまで、ステップを3.9から3.7を繰り返します。 4。肝細胞とSEC精製 3分間150 × gで細胞を含有する50mLのconicalsを遠心分離します。ペレット肝細胞へ。 氷の上で新鮮な50mLのconicalsする非実質細胞を含む液体フラクションを転送する。 肝細胞は、バッファ3にペレットを再懸濁し、ステップ4.1と4.2を3回繰り返すことが洗う。 洗浄の最後に、ペレットは≥97パーセント純粋な肝細胞です。 SECSを取得するには、管cのすべてを遠心10分間、200 xgで（造血幹細胞、SECS、およびKCSといくつかの小さな肝細胞を含む）上清をプールontaining。 4℃ バッファーを吸引除去し、4で5 mLのRPMI / BSA内のすべてのペレットを再懸濁℃を 2チューブに一緒に細胞をプールし、35 mLのボリュームを最大RPMI / BSAを加える。 3分を100 × gでconicalsを遠心分離します。 液体ときれいな50 mLコニカルへの転送の上位25 mLを収集する。 残りの10 mLの培地でペレットを再懸濁し、バック冷RPMI / BSAと3分を100 × gで遠心分離を25 mLを加え。 もう一度手順3.8と3.9を繰り返して、細胞ペレットと下位10 mLのメディアを破棄する。 10分間、200 xgでペレットSECS、KCS、および造血幹細胞にsupernatentsを遠心分離します。 4℃ 氷上でPBSで20mLの25％パーコールを含む3つの50 mLの試験管を準備します。各チューブに15 mLの50％パーコールとアンダーレイ。 30 mLのRPMI / BSAの合計容積に細胞ペレットを再懸濁します。 慎重にオーバーレイEAC4℃20分、900​​ xgで細胞と遠心を10 mL℃の時間勾配 SECSとKCSは非常に好調な密度を閉じて、50分の25％のインタフェースにありますしている。 25％/メディアは、脂質を格納する細胞としての高い浮力に起因する界面での造血幹細胞は、通常です。残りのすべての肝細胞と血液細胞は、低いbuoyanciesを持っているし、ペレット化。 50分の25％の界面付近のトップダウンから吸引し、この材料を捨てる。 50分の25％のインタフェースと冷RPMIと新鮮な円錐への転送に細胞を回収。最終容量は、パーコールを希釈するために〜40 mLのはずです。 4時10分、350 × gで円錐形を遠心° Cの細胞をペレット化する。 〜10 mLを予め温めておいたRPMIは酸洗浄ガラスペトリ皿または結晶皿の中で100 U / mLのPenicillin/100 g / mlのストレプトマイシンおよび場所の細胞を含むで細胞を再懸濁します。 15分間細胞をインキュベートする。組織培養インキュベーターで37℃。 ロックまたはスワールプレートを少しし、上清中のSECSを収集する。 KCSは、はるかに急速にSECS以上のガラスに付着する。また、SECSは、磁気ビーズに結合した抗CD31またはanti-Stabilin2/HARE抗体を用いた免疫精製によってKCSから分離することができる。 生存率と細胞数は血球計算盤を用いてトリパンブルー排除により、または自動細胞カウンターを用いて評価することができます。 37フィブロネクチンでコーティングされたプラスチック製の皿° C、5％CO 2、40 ng / mLのVEGF、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンを持つまたは肝細胞馴化培地とRPMI/0.25％のBSAでの文化は、SECS。 これらの培養方法を用いて肝細胞、KCS、およびSECSガンマカウンターで標識された物質の内部化のために評価し、細胞のタンパク質や顕微鏡での合計に正規化されることがあります（蛍光標識されている場合）。 5。代表的な結果： 肝細胞精製は≥97％であるとSECの精製はtypicです味方≥95％このメソッドを使用する。腹腔の切除、門脈のカニューレ挿入、および肝臓のブランチングは、すべての最良の結果を得るためには分以内に発生する必要があります。 HARE/Stabilin-2は、肝臓のSECS上の特定の受容体であり、他の肝臓の細胞型で発現されていません。このサンプルでは、肝細胞及びSECS両方の細胞溶解液を5％SDS – PAGEにより分離し、Stabilin – 2の両方のアイソフォーム（ 図3）に対するモノクローナル抗体でプローブ。 血流に注入された未分画ヘパリンは肝臓16でクリアされます。クリアランスは、主に肝細胞およびKCS 17〜対照的に、肝臓のSECSによって実行されます。 Stabilin-2/HARE受容体が結合し、SECS 18にヘパリン内部化メインクリアランス受容体である。ここに私たちの例では、我々はN -アセチルグルコサミン/ NSのカルボキシレート基上にビオチンタグを使用してヘパリンというラベルが付いて。ビオチンは、内部化ヘパリンのprotの検出のためのヨウ素化されたストレプトアビジンと結合させたeoglycan。放血30分後の注射に続いて標識したヘパリンの注入は、私たちはヘパリンのこの形式を内部化なる器官を監視することができます。この短い時間間隔で、肝臓は主なクリアランスの器官（ 図4）です。 より明確に細胞型がクリアランスに責任があるかを理解するために、我々は、0.05％BSAを添加したRPMI培地にI – SA – B – HEP 125を追加し、それが20分間肝臓を通って循環することができました。コラゲナーゼ消化し ​​、細胞の精製の ​​後、標識したヘパリンの大部分は肝細胞（ 図5）とは対照的に、SECSによって内在化されています。 図1基本的な肝臓のアーキテクチャ。 SECSは、正弦波の壁を形成し、通常は（円の小さなクラスター）窓のあるされています。星状細胞（HSC）は、クッパーCとは対照的にDisseのスペースに記載されています通常、正弦波の微小血管に存在するells（KCS）。肝細胞はDisseのスペースの反対側を占める。 図2。灌流装置の回路図。 A）肝臓の類洞のフラッシュ/洗濯時の装置のセットアップ。 TBSは1Lフラスコにあります。 B）コラゲナーゼで〜60 mlのBuffer 2を含む125mLのフラスコに、閉回路における肝臓の消化のために使用されます。排水ラインは、ゴム栓でノッチのカットを通じて廃棄物の容器からフラスコBに変更されます。酸素ラインは発泡避けるために、コラゲナーゼ（フラスコB）を含む緩衝液に浸漬されていません。各フラスコでストッパーは排水ラインの効率的な転送を可能にすると酸素ガスからの上昇圧力を防ぐために、ノッチです。 図3。 </strong>肝細胞調製物は、SECSで汚染されていません。精製された肝細胞のバッチ（レーン1）およびSECS（レーン2）からの細胞溶解物の等量の5％SDS – PAGEによって分離し、ニトロセルロースにブロットした。 HARE/Stabilin-2の両方のアイソフォーム（315 kDaと190 kDaの）に対して特異的なモノクローナル抗体＃30は溶解液をプローブするために使用されていました。 図4。器官の標識ヘパリンの分布。ラットを30分間125 I – SA – B – HEPの待機と外側尾静脈を介して注入し、放血した。血液は人工的にあらゆる臓器に高い測定値を与えるためにしないように、収集した。各器官の分当たりのカウント数（CPM）は、グラムの臓器の重量に対して正規化された。 図5肝細胞及びSECSで標識したヘパリンの量。 RPM125 I – SA – B – HEPを含む私のメディアは、コラゲナーゼ消化し ​​、細胞の精製に続いて20分間そのままに肝臓を通って循環させた。肝細胞およびSEC細胞の蛋白質の溶解物の等量のBradfordアッセイで定量し、ガンマカウンターでカウントした。 図6。クッパー細胞は、ガラス上に付着によってSECSから分離されています。細胞は酸洗浄ガラス結晶皿に入れ、37℃で15分間、5％CO 2のために付着させた。非付着細胞を含む上清を静かに旋回し、遠心管に入れていた。ガラスの両方の接着細胞（レーン1）から、非接着細胞（レーン2）から溶解液を8％SDS – PAGEにより分離、ブロッティング、およびクッパー細胞に特異的であるCD163に対する抗体でプローブした。 フィブロネクチン被覆プラスチックにメッキを図7。SECSを6ウェルディッシュは、0.1％BSAを添加したRPMIで一晩インキュベートした。位相コントラスト画像は、（A）100倍と（B）200倍の倍率で撮影した。