Lo studio del fegato cellule endoteliali sinusoidali (SEC) deve essere eseguita con le cellule primarie ottenute da animali, non esistono linee cellulari. Questo metodo si basa sulla digestione del fegato e centrifugazione differenziale per la purificazione SEC per la coltura successiva e sperimentazione.
Il fegato è il centro metabolico del corpo dei mammiferi e funge da filtro per il sangue. L'architettura di base del fegato è illustrata in figura 1 in cui è composto oltre l'85% della massa epatica di epatociti e il restante 15% della massa cellulare è composto da cellule di Kupffer (KCS), cellule stellate (HSC), e sinusoidale cellule endoteliali (SEC). SECS formano le pareti dei vasi sanguigni all'interno del fegato e contengono morfologia specializzate chiamate Fenestrae all'interno del citoplasma. Fenestrazione del citoplasma è la comparsa di buchi (~ 100 micron) all'interno delle cellule in modo che l'atto SECS come un setaccio in cui la maggior parte chilomicroni, i resti chilomicroni e macromolecole, ma non le cellule, passano attraverso la epatociti e HSC 1 (fig. 1). A causa della mancanza di una membrana basale, il divario tra i secondi e epatociti forma dello spazio di Disse. HSC occupare questo spazio e giocare un ruolo importante nella regolazione e la risposta di injury, stoccaggio di acido retinoico e immunoregolazione dei 2 fegato.
SECS sono tra le cellule più endocytically attiva del corpo con un vasto insieme di recettori scavenger sulla loro superficie a 3 celle. Questi includono SR-A, Stabilin-1 e Stabilin-2. In generale, le piccole particelle colloidali meno di 230 nm e macromolecole in fase di buffer sono ripreso da SECS, mentre le particelle più grandi e detriti cellulari è endocitosi (fagocitati) di KC 4. Così, la clearance maggior parte del materiale extracellulare come la glicosaminoglicani dal sangue è in gran parte dipende dalla salute e delle funzioni di endocitico SECS 5,6. Per esempio, un aumento dei livelli ematici di acido ialuronico è indicativo di malattia del fegato che vanno da lievi a forme più gravi 7.
Con l'eccezione di un rapporto di 8, non ci sono immortalati SEC linee cellulari esistenti. Anche questa linea di cellule immortalizzate è de-differenziareated in quanto non esprime recettori scavenger che sono presenti sul SECS primari (i nostri dati, non riportati). Tutti gli studi cellula biologica deve essere eseguita su cellule primarie appena ottenuto dall'animale. Purtroppo, SECS dedifferentiate in condizioni di coltura standard e deve essere utilizzato entro 1 o 2 giorni su isolamento dall'animale. Differenziazione delle SECS è segnata dall'espressione di Stabilin-2 o recettori LEPRE 9, CD31, e la presenza di fenestrazione citoplasmatici 1. Differenziazione delle SECS può essere esteso con l'aggiunta di VEGF nei terreni di coltura o da cellule in coltura degli epatociti mezzo condizionato 10,11.
In questo rapporto, dimostreremo l'attività endocitico di SECS nell'organo intatto utilizzando radio-marcato eparina per acido ialuronico per la SEC specifici Stabilin-2 recettore. Ci sarà poi purificare epatociti e SECS dal fegato perfuso di misurare endocitosi.
Anestesia del ratto con il metodo goccia in cui isoflurano vapore induce incoscienza è il metodo preferito per i nostri studi. Un vaporizzatore può anche essere usato al posto di una siringa con cotone per mantenere l'animale al di fuori della camera, ma le procedure chirurgiche sono così veloce, non è necessario. Polietilene glicole viene aggiunto al isoflurano per diminuire la pressione del vapore e la velocità di evaporazione. Troppo vapore isoflurano può indurre la morte troppo in fretta. Se l'animale muore prima che il fegato è cannulato e scottati con TBS, coaguli di sangue possono mettere in comune a livello epatico e prevenire lavaggio efficiente delle sinusoidi e la digestione con collagenasi. L'aggiunta di eparina può essere utile come anticoagulante, ma non è utilizzata in questi studi dato che usiamo eparina etichettati come la nostra sonda.
Soluzione salina tamponata di Gey (GBSS) è spesso sostituito da altri laboratori per la purificazione del sec. Mentre è utile per la purificazione SEC, l'epatiteatocytes non tollerano GBSS così come buffer 1-3 e Viabilità non sono così alti. Quando si misura endocitosi, è buona per misurare i livelli di fondo in organo e in purificata epatociti.
Questo metodo è uno dei due per la depurazione efficiente SECS dopo la perfusione del fegato con collagenasi. L'altro metodo separa le cellule non-parenchimali per centrifugazione elutriation 19 anzichè il gradiente Percoll. I vantaggi per l'utilizzo di elutriation su gradienti di Percoll sono Viabilità cellule leggermente più alta e numeri. Lo svantaggio è che centrifugazione elutriation richiede un rotore specializzato, centrifuga dedicata, e la pompa peristaltica insieme che costa decine di migliaia di dollari. Questo metodo richiede solo l'uso di una centrifuga refrigerata da tavolo e la pompa peristaltica, che è standard in molti laboratori.
Separazione di secondi e KC di adesione selettiva è un metodo standard20-22. Se è vero che SECS aderirà al vetro e plastica, il punto chiave è quello di utilizzare lavata con acido vetro pulito, con non più di 15 minuti di incubazione a 37 ° C al 5% di CO 2. KC sarà sempre più veloce di aderire secondi e si consiglia di lavare delicatamente il KC con i media per estrarre qualsiasi SECS rimanenti che si sono vagamente collegati. Pronasi e altre proteasi sono omessi dai passi della digestione collagenasi in questo protocollo per aumentare Viabilità delle cellule. Proteasi digerire recettori extracellulari e può inibire l'adesione cellulare nelle fasi di purificazione finale.
Il metodo presentato qui ha una grande varietà di applicazioni. Anche se si mostra il risultato finale in cui l'eparina viene inizialmente assunto per la liquidazione, la perfusione del fegato per ottenere epatociti primari, KC, SECS, e CSE può essere utile per una serie di studi che coinvolgono vie metaboliche, immunoregolazione, attività scavenger, e altri Studi fisiologicies. La parte più difficile di questa procedura è incannulazione buona, la digestione del fegato, e la gestione del fegato senza avere la polizza catetere dalla vena porta.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare il Dr. Paul Weigel presso l'Univ. dell'Oklahoma per l'utilizzo di anticorpi monoclonali 30 per il rilevamento del recettore HARE/Stabilin-2 e Janet Weigel per la sua assistenza tecnica. Questa ricerca è finanziata da fondi di ricerca dell'Università di Nebraska.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |