Quantificare Decrementa cognitivi causati da radioterapia craniale

I nostri paradigmi test cognitivi sono schematicamente rappresentata nella Figura 1. Test cognitivi è iniziata un mese dopo l'irradiazione e interventi chirurgici vengono eseguiti. Condurre la Place Novel Riconoscimento (NPR) Task The Place Novel Recognition (NPR) compito è sulla base di procedure descritte da Mumby e colleghi (2002), ed è un compito di memoria di riconoscimento spaziale che si basa su l'ippocampo 4. I ratti sono dapprima familiarizzare con il contesto test mettendoli nelle arene di prova (su misura, bianco, acrilico, box open top, 70cm x 70cm X 40cm di altezza) per 20 minuti una volta al giorno per tre giorni. Gli oggetti che non saranno utilizzate per i test dopo sono collocati nelle arene durante queste sessioni di assuefazione. Per la fase di assuefazione, osservazioni manuale di comportamento esplorativo Va notato, durante la registrazione e il monitoraggio dei comportamenti non sono necessari. Per tutte le fasi del compito NPR, le arene sono puliti a fondo tra gli animali utilizzando etanolo al 70% al fine di minimizzare spunti odore di confondimento. Per tutte le prove, gli animali sperimentatori posto al centro delle arene di prova in un orientamento coerente per ridurre al minimo la possibilità che gli animali si limiterà a esplorare il blocco che si trovino posto accanto a. La fase di familiarizzazione e 5 minuti in fase di test vengono somministrati al quarto giorno. Per la fase di familiarizzazione, due blocchi di plastica identici (8 cm x 3cm x 10cm di altezza) che sono stati accuratamente puliti con etanolo al 70% sono collocati in posizioni specifiche all'interno delle arene di prova. Un animale viene posto in ogni arena per 5 minuti e ha permesso di esplorare liberamente. Esplorazione delle due posizioni ugualmente-familiare spaziale è valutato con il sistema automatizzato di monitoraggio. Per tutte le fasi, l'esplorazione è il punto il naso di un animale è un raggio di 4 centimetri e diretto verso i blocchi. Perllowing la fase di familiarizzazione, gli animali siano posti in una gabbia piccola azienda per un intervallo di 5 minuti di ritardo. Durante questo periodo, le arene di prova vengono puliti con etanolo al 70%, e copie identiche dei blocchi è aggiunto uno in una posizione identica spaziale durante la fase di familiarizzazione, ed uno in una posizione romanzo spaziale. Se un ratto ricorda la disposizione spaziale dei blocchi dalla fase di familiarizzazione, la spesa sarà più tempo per esplorare il blocco si trovano nella locazione romanzo spaziale. Dopo l'intervallo di 5 minuti di ritardo, gli animali vengono restituiti alle arene di prova per i 5 minuti in fase di test. Essi esplorare liberamente per 3 minuti. 24 ore dopo la fine della fase di familiarizzazione, gli animali vengono restituiti alle arene di nuovo per il test di 24 ore fase di test. Per questa fase, ad un isolato rimane nella stessa posizione durante la familiarizzazione e 5 minuti di fasi di test, e l'altro blocco è collocato in un nuovo romanzo posizione spaziale. Anche in questo caso, se un re topomembri la disposizione spaziale dei blocchi, dalla fase familiarizzazione il giorno prima, si passerà più tempo per esplorare il blocco si trovano nella locazione romanzo spaziale. Ora, la quantità di tempo trascorsa a visitare i blocchi nelle varie posizioni dello spazio sono raccolti con il programma automatico di tracciamento, e possono essere analizzati statisticamente per le differenze tra i gruppi sperimentali. Per la fase di familiarizzazione, tempo totale di esplorare entrambe le posizioni spaziali attraverso l'intero processo viene calcolato. Non ci dovrebbe essere differenza di tempo trascorsa a visitare le due posizioni spaziali in questa fase in quanto sono altrettanto familiari / non familiari agli animali (Fig. 2A). Inoltre, differenze significative di esplorazione totali tra i gruppi sperimentali possono indicate variations gruppo nei livelli di motivazione per esplorare o l'ansia e dovrebbero essere considerati quando si interpretano con una memoria di riconoscimento spaziale dei due fasi di test. Per entrambe leDi 5 minuti e 24 ore fasi di test, un rapporto di esplorazione è calcolato come segue: il tempo trascorso esplorando posizione romanzo – il tempo trascorso esplorando posizione familiare / tempo totale di esplorare (Fig. 2B). In questo modo, la variabilità individuale nella motivazione per esplorare gli oggetti viene presa in considerazione. Animali normali spendono molto più tempo esplorando la posizione spaziale romanzo del previsto per caso (indicata dalla linea tratteggiata) a seguito del ritardo intervalli di 5 minuti e 24 ore (Fig. 2B). Rapporto di esplorazione è di solito calcolato per i primi 60 secondi del test di 5 minuti e 24-ore 4. Questo perché, come l'avanzamento del test prove, la posizione spaziale romanzo diventa più familiare agli animali. Così, il primo minuto delle prove test fornisce la valutazione più accurata della memoria di riconoscimento spaziale. 2. Condurre la Maze elevati Plus (EPM) Task ElevatedPiù Maze (EPM) compito è basato su procedure da Walf e Frye, 2007 5. Il compito EPM è utilizzata per valutare l'ansia nei roditori. L'apparato EPM è un 4-braccio labirinto (45 "X 4") ha sollevato 45 "dal livello del pavimento, con le braccia disposte a forma di più. Due armi sono chiusi e due sono aperti. L'apparecchio mostrato è prodotto da Med Associates Inc . Comportamento durante questa operazione riflette un conflitto tra motivazione naturale del ratto di esplorare ambienti romanzo (il tempo trascorso a braccia aperte) e la preferenza per restare in aree protette (braccia chiuso). La sala sperimentale è illuminato con faretti puntato verso il labirinto di assicurare adeguata motivazione a preferire la chiusa, più debolmente illuminato armi. Il labirinto viene pulita a fondo prima che il primo animale è testato, e tra ogni prova. L'animale si trova nel dispositivo tenendolo sotto le zampe anteriori e l'immissione nella parte centrale del labirinto, di fronte al braccio aperto che è lontano dallo sperimentatore. Ogni prova dura per 5 minuti. Il percorso dell'animale è monitorato tramite il software di tracciamento automatico in modo che il numero di voci e quantità di tempo trascorso tra le braccia aperte e chiuse può essere calcolato. Comportamenti aggiuntivi come cali l'allevamento, la cura e la testa sul lato del dispositivo può essere monitorato. Una voce viene conteggiato quando il punto centrale dell'animale croci in un braccio. Se un ratto cade il labirinto, è rapidamente reimmessi sul braccio aperto dal quale è caduto, e l'evento viene registrato nel notebook osservazione. Se un ratto si blocca per un lungo periodo di tempo, il comportamento, insieme ad eventuali possibili cause (ad esempio improvvisa, forte rumore fuori dalla stanza di prova) sono noti, e la sperimentazione continua in modo che tutti gli animali da esperimento hanno tempi di esposizione simili. Il tempo trascorso tra le braccia aperte contro chiusa viene utilizzato per calcolare il rapporto: tempo in braccia aperte / tempo totale in armi. Allo stesso modo, il rapporto tra voci braccia aperte rispetto al totale dellevoci braccio è calcolato. Utilizzando il software automatizzato di tracciamento, la distanza totale percorsa e la velocità può essere misurata anche al fine di valutare eventuali differenze nella funzione motoria tra i gruppi sperimentali. Diminuzione ansia è associata a una maggiore percentuale di tempo trascorso tra le braccia aperte, mentre l'ansia e la paura maggiore sono associati con più tempo speso nei bracci chiusi. Animali normali spendono molto meno tempo nella braccia aperte del previsto per caso (indicata dalla linea tratteggiata, fig. 3). Animali più ansioso spenderà meno tempo proporzionalmente tra le braccia aperte, mentre gli animali meno ansioso passerà più tempo tra le braccia aperte (per esempio, dopo esposizioni multiple al labirinto oa seguito di trattamento con farmaci ansiolitici). 3. Condurre la contestuale e Cued condizionamento alla paura (FC) Task Contestuale e Cued paura condizionata (FC), le descrizioni delle attività sono basate su procedure da SchafE et al., 1999, Winocur et al., 2006 e MacLeod et al., 2007 6-8. Il condizionamento alla paura (FC) compito è un paradigma comportamentale nel quale gli animali imparano a temere uno stimolo precedentemente neutro (un contesto, una luce o un tono, lo stimolo condizionato), associandolo a stimoli nocivi (di solito un lieve footshock, lo stimolo incondizionato ). L'apprendimento è veloce, robusto e di lunga durata e, quindi, il compito FC viene utilizzato spesso per studiare i circuiti neurobiologici dell'apprendimento e della memoria nei roditori. L'apparato FC è un 30 centimetri X 30cm X 40cm camera alta chiusi (Phenotyper, Modello 3000, Information Technology Noldus). Il pavimento della camera è costituito da una griglia in acciaio inox che vengono usati per fornire lo stimolo shock. Il Phenotyper è dotato di un altoparlante che emette un 2300Hz, 90dB tono su richiesta, in qualità di stimolo condizionato. Lo shock è espresso tramite un generatore di shock (Med Associates Inc.). Lo shock è un disagio momentaneo che non produce lasTing dolore o danni ai tessuti. Per entrambi la formazione e gli studi di prova, la consegna dello shock e stimoli tono è a tempo e controllato automaticamente utilizzando il XT Ethovision add-on Trial e modulo di controllo hardware (versione 7.0, Information Technology Noldus). Il primo giorno, la formazione FC è condotta. Il Phenotyper viene pulita a fondo con etanolo al 70%, e un animale singolo è posto nella camera. Il processo formativo si articola su tre fasi: (1) una fase basale, in assenza di shock o tono è amministrato, (2) una fase di formazione, quando il tono-shock abbinamenti sono presentati, e (3) una fase di post-formazione, quando non shock o tono è somministrato. Ogni fase dura circa 5 minuti per un tempo totale di processo di formazione di 15 minuti per ogni animale. Durante la fase di formazione, il tono è somministrato per 30 secondi e coincidente con la fine del tono, un 1mA shock è consegnata alla rete per 1 secondo. Questo tono-shock accoppiamento è ripetuta per un totale di 5 volte, con una variabile 10-60 seco° spaziatura intervallo tra ogni accoppiamento. Dalla fase di formazione, la percentuale di tempo ogni animale trascorre immobile, o il congelamento, si misura dalla finale 60 secondi della fase iniziale di riferimento (per stabilire congelamento spontaneo prima il tono-shock abbinamenti) e dalla finale 60 secondi di post -formazione di fase (per stabilire il comportamento di congelamento in risposta al tono-shock abbinamenti). Animali normali mostra livelli molto bassi di congelamento durante la fase di baseline e molto elevata (~ 95%) i livelli di congelamento durante la fase post-allenamento (Fig. 4). 24 ore dopo, l'animale viene restituito al contesto identici e osservata per il test 5 minuti FC contestuale. Nessun urto o tono viene consegnato in questa fase, e la percentuale di congelare il tempo trascorso è calcolato per tutto il processo. Si noti l'importanza di mantenere costante il contesto, dalla formazione alla prova contesto. Infatti, avendo lo sperimentatore stesso maniglia e prova gli animali in entrambe le giornate è nesario. Animali normali spendono circa il 70% del processo contesto impegnato in comportamenti di congelamento (Fig. 4). Il test cued FC è somministrato un'ora dopo. Il contesto della camera è cambiata rimuovendo il piano della griglia, l'aggiunta di pannelli al di fuori della camera, e pulire il pavimento con un detergente profumato. Behavior congelamento dell'animale è osservato per il primo minuto, e livelli di congelamento sono molto bassi se il contesto è stato sufficientemente alterato (Fig. 4). Il tono è poi giocato per 3 minuti, seguito da un minuto di silenzio finale, e il tempo trascorso congelamento percentuale è calcolata. Animali normali mostrano alti livelli di congelamento durante questo periodo (Fig. 4). In totale, 5 misure discrete di comportamento congelamento sono raccolti; (1) al basale, (2) post-formazione; (3) test di contesto; (4) pre-cue test; (5) test di spunto e post-cue. Assenza di congelamento durante la fase di baseline stabilisce livelli di ansia normale, mentre sostanziale congelamento durante la fase post-allenamento suggerisce intatta capacità senso-motorio. Congelamento durante il test di contesto fissa di 24 ore di memoria per il contesto di formazione, che si basa su intatti funzione dell'ippocampo e dell'amigdala 9. La mancanza di pre-cue congelamento prova suggerisce alterazione sufficiente per il contesto di formazione iniziale. Congelamento Cue e post-cue fissa di 24 ore di memoria per lo stimolo tono, che si basa su intatta la funzione dell'amigdala 9. 4. Condurre il Morris water maze (MWM) Task Morris Water Maze compito procedure sono basate su descrizioni precedenti 10,11. L'acqua Morris maze (MWM) compito è un test di apprendimento spaziale per i roditori che richiede l'uso di indicazioni distale per individuare una piattaforma di fuga immerso in una grande piscina di acqua opaca. Large, spunti distinte visivi sono disposti intorno alla piscina in specifici, luoghi costante. Gli animali imparano a usare questi spunti per passare al submerged piattaforma. Gli animali vengono monitorati e rimossi dall'acqua, se non sono in grado di nuotare. Apprendimento spaziale viene valutato attraverso prove ripetute e la memoria di riferimento è determinato valutando la preferenza per l'area della piattaforma quando la piattaforma è assente. Prove inversione migliorare la rilevazione di alterazioni spaziali, e può tassare regioni cerebrali aggiuntive, come la corteccia frontale 10. Il compito MWM è somministrato oltre 8 giorni e si compone di 4 fasi: una prova cued, una fase di acquisizione, una prova di rilevazione 24 ore e un test di inversione di apprendimento. La piscina è una misura bianco, serbatoio in polietilene, 200cm di diametro e alta 60cm. E 'pieno di acqua fino a circa 30cm profondo e reso opaco con il bianco, vernice atossica. La temperatura dell'acqua è mantenuta tra il 20 e 22 ° C (68 e 72 ° F). La piattaforma di fuga è una custom-made, supporto in plastica trasparente con una circolare in alto misura 10 centimetri di diametro. Si trova a circa 1,5 centimetri sotto la superficie del water. Il test cued è composto da 4 prove somministrati il ​​giorno 1. Per questi studi, una bandiera distinta in bianco e nero è posta al centro della piattaforma in modo che la posizione di fuga è ovvio per gli animali. Per ridurre al minimo l'utilizzo delle informazioni territoriali in questa fase, stecche da parete vengono rimossi e la piattaforma e iniziare a posizioni sono diverse da prova a prova. Questa fase consente di escludere qualsiasi senso-motorie legate differenze tra i gruppi sperimentali prima fase di acquisizione ha inizio. Per tutte le fasi del compito MWM, gli animali sono tenuti sotto l'arti anteriori e delicatamente posto in acqua nella posizione di partenza designato, di fronte al muro della piscina. Gli animali sono stati testati in coorti di modo che ci sia un 8 a 10 minuti tra le prove intervallo tra ognuna delle 4 prove quotidiane 8. Tra una prova intervalli, gli animali sono tenuti in gabbie di riscaldamento per evitare l'ipotermia. Per la prova cued, un tempo di nuotare massimo di 30 secondi è consentita per l'animale a salire sulpiattaforma. Se il tempo massimo è raggiunto prima della fuga degli animali, lo sperimentatore lo guida alla piattaforma a mano e la mette sulla piattaforma. L'animale rimane sulla piattaforma per un periodo di riposo di 20 secondi prima di essere immessi in una gabbia riscaldamento. Per ogni prova, prova cued, l'animale viene avviato da un altro, pre-determinata location partono il perimetro della piscina, e la piattaforma è anche spostato a ciascuno dei quadranti 4 posizioni diverse. La fase di acquisizione ha inizio il giorno successivo e si compone di 4 prove al giorno per 5 giorni consecutivi. Durante questa fase, la piattaforma nascosta rimane nella stessa posizione e gli animali imparano a navigare usando i segnali camera distale. Ancora una volta, per ciascuna delle 4 prove, l'animale viene posto in piscina a un altro, pre-determinato punto di partenza. Ogni giorno, due dei punti di partenza sono a sinistra e due dei punti di partenza sono a destra della piattaforma, in ordine casuale, per evitare lo sviluppo di egocentric strategie spaziali per risolvere il compito. Il tempo massimo di nuoto per ogni prova di acquisizione è di 60 secondi, dopo di che l'animale è guidata e posto sulla piattaforma dallo sperimentatore. L'animale rimane sulla piattaforma per 20 secondi dopo fuga. Il giorno 7, 24 ore dopo il processo di formazione finale, una di 60 secondi di prova della sonda viene somministrato in cui la piattaforma è stata rimossa. Questa fase determina la preferenza dell'animale per il quadrante che usato per contenere la piattaforma ed è utilizzato come misura della memoria di riferimento spaziale 10. Dopo la prova della sonda, la piattaforma viene restituito al quadrante stesso e 3 prove di acquisizione regolare somministrazione. Per l'inversione di apprendimento di test il giorno 8, la piattaforma viene spostato in una nuova posizione al fine di valutare la capacità di inversione di apprendimento. Misurare la quantità di animali trascorrono il tempo alla ricerca per la piattaforma nella posizione precedente contro la sua nuova posizione fornisce una valutazione di perseverazione, o inabilità di sopprimere la risposta alla posizione precedente una volta che la piattaforma è stato spostato 10. Per quanto riguarda le fasi di acquisizione e sonda, 4 prove di 60 secondi vengono somministrati. Per la prova cued, la latenza per trovare la piattaforma e la velocità sono usate come misure di visiva e funzione motoria, rispettivamente. Le differenze tra i gruppi sperimentali in questa fase devono essere presi in considerazione nella interpretazione dei risultati di acquisizione e di memoria come le differenze di funzioni senso-motorie tra i gruppi possono esistere. Per la fase di acquisizione, latenza media per trovare la piattaforma e / o la lunghezza del percorso vengono usate come misure di apprendimento spaziale. Negli animali normali, sfuggire la latenza diminuisce gradualmente nel corso dei cinque giorni di acquisizione in modo tale che il tempo medio di fuga è di circa 15 a 20 secondi il giorno 5 (Fig. 5A). Per la fase di sonda, distanza media di piattaforma (Fig. 5B) e / o la latenza per raggiungere prima posizione precedente della piattaforma (Fig. 5C </strong>) sono usate come misure di memoria di riferimento spaziale. Per la fase di inversione, il tempo speso per cento nel quadrante vecchio contro nuovo che contiene la piattaforma è utilizzata come misura di perseverazione. Nel corso dei quattro prove, la preferenza per la posizione vecchia piattaforma dovrebbe diminuire con preferenza per la posizione nuova piattaforma è stabilito (Fig. 5D). 5. Rappresentante dei risultati: Figura 1. Rappresentazione schematica dei nostri paradigmi di test cognitivi. Figura 2. I risultati rappresentativi da animali di controllo al tipo di riconoscimento romanzo luogo. A) Il tempo totale trascorso esplorando le due posizioni spaziali dovrebbe essere approssimativamente uguale durante la fase di familiarizzazione. B) Rapporto di esplorazione (tempo trascorso esplorando romanzo Posizione / ora trascorsa a visitare entrambe le posizioni) mostra una netta preferenza per la posizione spaziale romanzo seguendo i tempi di ritardo di 5 minuti e 24 ore. La linea tratteggiata indica le prestazioni caso. Figura 3. I risultati rappresentativi da animali di controllo sul labirinto più elevato. Animali normali passare meno tempo del previsto per caso tra le braccia aperte (indicata dalla linea tratteggiata). Animali ansioso spenderà tempo proporzionalmente meno in braccia aperte rispetto ai controlli, mentre le esposizioni multiple per il labirinto o il trattamento con farmaci ansiolitici aumenta il tempo trascorso in braccia aperte. Figura 4. I risultati rappresentativi da animali di controllo il compito condizionamento alla paura. Bassi livelli di congelamento osservati durante la prima esposizione alla camera (baseline), E quando il contesto è alterato prima della prova spunto (pre-cue test). Al contrario, gli animali normali passano la maggior parte del periodo post-allenamento impegnato nel comportamento di congelamento. Se gli animali ricordare il contesto in cui la formazione si è verificato a seguito di un ritardo di 24 ore, essi assumono un comportamento di congelamento di circa il 70% dei 5 minuti di prova contesto. Allo stesso modo, se gli animali ricordano il tono, mostrano alti livelli di congelamento durante la prova di spunto e post-cue. Figura 5. I risultati rappresentativi da animali di controllo il compito Morris Water Maze. A) diminuisce la latenza fuga con una formazione progressiva durante la fase di acquisizione. B) e C) media distanza e la latenza di attraversare prima la posizione precedente piattaforma durante il test della sonda 24 ore sono usate come misure di memoria di riferimento spaziale. D) Inversione di apprendimento viene valutata modificando la posizione della piattaforma, l'ultimo giorno di testing. Nel corso dei 4 prove, a poco a poco gli animali normali smettere di cercare il quadrante vecchio e imparare che la piattaforma è in una nuova posizione.