Ex vivo de imagens de células T em fatias Node murino linfáticos com Widefield e microscópios confocal

1. Preparação de fatias de linfonodos Prepare a 4% de baixo ponto de fusão de solução de agarose para a incorporação. Diluir agarose em PBS e microondas esta solução. Quando a agarose é completamente dissolvido, manter a solução a 37 ° C até que esteja pronto para uso. Prepare um 6 bem-placa de cultura de tecidos. Adicionar 1,1 ml meio de cultura RPMI completo por poço, e inserir um filtro organotípicas em cada poço. Coloque a placa de seis poços a 4 ° C até que esteja pronto para transferir fatias. Coloque arruelas de aço inoxidável, com diâmetros interno de 4 mm, em um prato de plástico cheio de meio RPMI completo. Arruelas serão mais usados ​​para concentrar as células na fatia cortada vibratome. Sacrificar o rato, em conformidade com as normas de bem-estar animal local. Remova cuidadosamente os gânglios linfáticos periférico do tecido circundante e coloque-os em um prato de plástico contendo gelada PBS. Cuidados devem ser tomados para não danificar a estrutura dos linfonodos, como estes órgãos são muito macios. Despeje a 4%-agarose gel em um prato de plástico de 35 mm e delicadamente os nós de transferência para o gel. Deixe o gel agarose em gelo por 5 min para endurecer. Remover o bloco do prato e cortar o agar, a fim de deixar 3-5 mm de gel em torno de cada nó de linfa. Anexar os nós embutido no disco exemplar do vibratome com non-toxic cola de tecido. Instalar o disco de amostra na bandeja cheia de gelado PBS. Seção agar-embedded tecido em 320 mM espessura com a velocidade vibratome conjunto em uma série lenta (0,3 mm / s) ea freqüência de vibração em um conjunto de gama média (1,5 mm). Transferir cuidadosamente fatias linfonodo como eles estão sendo cortados para a cultura insere organotípicas usando uma pinça fina. Coloque 3 fatias em cada inserção. Tenha muito cuidado como fatias pode ser facilmente danificada. Um linfonodo periférico típico renderá 5 seções quando cortado a 320 mM. Descartar as fatias e sobrenome, como eles só contêm tecido superficial. Coloque anilhas de aço inox em cada fatia individual. Certifique-se de arruelas são bem posicionado na agarose em torno do tecido. Incubar a placa de cultura a 37 ° C em 5% incubadora de CO 2 umidificado até que esteja pronto para as células T placa. 2. Isolamento de células T dos linfonodos do mouse Isolar as células T de acordo com o artigo JOVE anteriormente publicados 3. Utilização de células T imediatamente e prosseguir para a próxima seção. Caso contrário, os linfócitos podem ser cultivadas durante a noite em completa meio RPMI suplementado com 10 ng / ml de IL-7. 3. Rotulagem dos isolaram células T Lavar as células em HBSS. Ressuspender-los no mesmo tampão de 10 x 10 6 por ml. Adicionar o mesmo volume de HBSS contendo 1 mM celular Rastreador verde CMFDA dando uma concentração final de 0,5 mM. Incubar a suspensão de células a 37 ° C durante 5 min. Lave as células duas vezes com RPMI médio completo. Ressuspender as células em uma concentração final de 10 x 10 6 por ml em meio RPMI completo. Estas células marcadas serão semeados em fatias. Outros corantes fluorescentes que CMFDA pode ser usado também, mas tenha em mente que estas moléculas são potencialmente tóxicos acima de determinadas concentrações. 4. Chapeamento rotulados células T em fatias linfonodo Remova o meio de excesso contido na parte interna da máquina de lavar com uma pipeta. Não permita que o tecido se torne seca; trabalhar rapidamente durante esta etapa. Suavemente dispensar 10-20 mL células T rotulados que corresponde a 1-2 x 10 5 células na parte interna da máquina de lavar. É preciso ter cuidado para não tocar o tecido com a ponta da pipeta. Certifique-se que a gota de suspensão de células permanece no local. Coloque as fatias com células em estufa a 37 ° C e 5% CO 2 por pelo menos 30 min para permitir que os linfócitos para migrar para o tecido. 5. Células T de imagens dentro de fatias de linfonodo Neste vídeo-artigo, que as células T imagem fluorescentes em fatias de linfonodo com um microscópio de campo amplo invertido e um microscópio confocal vertical. Definir a temperatura a 37 ° C. Nossos microscópios estão equipados com câmaras de temperatura controlada. Instalar um sistema de perfusão permitindo a perfusão contínua da fatia de linfonodo com oxigenada (5% CO 2, 95% O 2) fenol meio RPMI red-free. No nosso sistema, media perfundidos entra na câmara de imagem de um lado pela gravidade. O meio é aspirado com uma bomba ligada a um frasco de coleta de resíduos. Definir a taxa de fluxo de mídia para 1 ml / min. Com uma pinça fina, delicadamente retire a fatia do prato 6-bem e mergulhe a preparação em meio RPMI oxigenado aquecido por alguns segundos para se livrar de células fluorescentes não infiltradas no tecido. Imaging células T com um microscópio de campo amplo invertida Coloque a fatia de cabeça para baixo em uma câmara de imagem feito por encomenda, que consiste em fios de nylon colados na parte interna de um prato fundo de vidro. Nesta câmara, os fios de nylon elevar a fatia do vidro e permitem que a solução oxigenada para difundir no tecido. Isto é necessário como T migração celular em linfonodos é fortemente dependente de oxigênio. Segura a fatia acrescentando por cima em uma arruela de aço inoxidável. Nessas condições, a fatia está alguns mícrons acima do fundo do prato, o que facilita a renovação da solução de perfusão. Para capturar um grande campo de visão (800 x 800 mM, aproximadamente um terço da superfície do nó fatia), recolher imagens usando uma lente objetiva de 10x e seco. Nós descobrimos que a Nikon 10x S fluor 0,5 NA foi mais adequado para nossas análises. Uma experiência de imagens típicas de lapso de tempo captura 5 aviões óptico abrangendo uma profundidade total de 50 mm na dimensão axial (z). Células T fluorescentes são normalmente fotografada em intervalos que variam 10 a 30 segundos durante 10 a 20 min. Células T de imagem com um microscópio confocal vertical O microscópio confocal utilizado neste protocolo é um SP5 Leica equipada com uma objetiva de imersão de água 20x (Olympus, 20x/0.95 NA). Segura a fatia para o palco de imagens do microscópio. Nota: Nós geralmente lugar uma máquina de lavar na preparação para imobilizá-lo. Definir uma sessão de imagem através da recolha de uma série de imagens ao longo do eixo z. Para as células T de imagem em uma estrutura de tecido intacto, a posição de início é geralmente definida em 5 a 10 mM abaixo da célula T primeiro rotulados. 6. Resultados representativos Seguindo este vídeo protocolo você deve esperar para visualizar um grande número de células T fluorescentes acumuladas na zona T do nó, um fenômeno que normalmente ocorre nesse ambiente específico in vivo (Figura 1). Em particular, as células T devem ser excluídas das zonas de células B, que são geralmente logo abaixo da cápsula. A experiência bem sucedida também irá resultar em células T recrutados para o tecido (Figura 2), exibindo um comportamento altamente móveis (Figura 3) consistentes com os resultados publicados obtidos nos gânglios linfáticos intactos 4. Em média, a velocidade média de células T individuais dentro fatias devem ser cerca de 10 mM / min (Figura 4). Figura 1. As células T se acumulam em uma fatia de linfonodos. Células fluorescente marcado T (CMFDA, verde) foram adicionados a um nó de linfa fatia min 30 antes de aquisição de imagem (imagem acima). A imagem é a projeção máxima de 5 imagens que mede 50 mm na direção z. A imagem de campo claro é mostrado na parte inferior. Imagens foram capturadas com um microscópio de campo amplo. Figura 2. As células T são recrutados para uma fatia de linfonodos. Células fluorescente marcado T (CMFDA, verde) foram adicionados a um nó de linfa fatia min 30 antes de aquisição de imagem usando um microscópio confocal. Imagens foram capturadas na superfície de corte (figura superior) e 40 mM abaixo (foto inferior). Figura 3. As células T são altamente móveis dentro de uma fatia de linfonodos. Fluorescente marcado células T foram fotografadas durante 12 min usando um microscópio de campo amplo. Trajetórias de células T individuais são exibidos como codificados por cores para representar faixas deslocamentos crescentes de azul (baixo células móveis) ao vermelho (alto células móveis). Faixas foram calculados utilizando software Imaris. A linha branca segue a borda do nó, enquanto a elipse tracejada delimita a zona de células B putativa. Figura 4. Dentro de uma fatia de linfonodos, a velocidade de células T é cerca de 10 mM / min. As velocidades foram calculadas utilizando software Imaris de faixas representadas na Figura 3.