Ex vivo l'imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

1. Préparation des tranches à partir des ganglions lymphatiques Préparer un 4% à faible point de fusion d'agarose solution pour incorporer. Diluer agarose dans du PBS et micro-ondes cette solution. Lorsque l'agarose est complètement dissous, de maintenir la solution à 37 ° C jusqu'à utilisation. Préparer une plaque de 6 puits de culture de tissu. Ajouter 1,1 ml du milieu RPMI complet de culture par puits, et d'insérer un filtre organotypique dans chaque puits. Placer la plaque de 6 puits à 4 ° C jusqu'au moment de transfert de tranches. Placez les rondelles en acier inoxydable, avec un diamètre intérieur de 4 mm, dans un plat en plastique rempli d'un milieu RPMI complet. Rondelles sera en outre utilisée pour concentrer les cellules sur la tranche coupée vibratome. Sacrifice de la souris en conformité avec les règles locales de protection des animaux. Retirez délicatement les ganglions lymphatiques périphériques du tissu environnant et les placer dans un récipient de plastique contenant PBS glacé. Des précautions doivent être prises pour ne pas endommager la structure des ganglions lymphatiques, car ces organes sont très doux. Verser les 4%, gel d'agarose dans un plat en plastique de 35 mm et délicatement le transfert des nœuds dans le gel. Laissez le gel d'agarose sur la glace pendant 5 min à durcir. Retirer le bloc de l'antenne et les garnitures de la gélose, afin de laisser 3-5 mm de gel autour de chaque noeud lymphatique. Fixez les noeuds embarqués sur le disque spécimen de la vibratome avec de la colle tissulaire non-toxique. Installez le disque spécimen dans le plateau rempli de PBS glacé. Section de l'agar-tissu inclus à 320 um d'épaisseur avec la vitesse vibratome mis sur une gamme lente (0,3 mm / s) et la fréquence de vibration mis sur une gamme moyenne (1,5 mm). Soigneusement transfert de tranches de ganglions lymphatiques comme ils sont coupés sur les inserts culture organotypique l'aide de pinces fines. Déposer 3 tranches sur chaque insert. Utiliser le plus grand soin que les tranches peuvent être facilement endommagés. Un ganglion lymphatique périphérique sera typiquement un rendement de 5 sections lorsqu'il est coupé à 320 um. Jeter les tranches premier et le dernier, car ils ne contiennent que des tissus superficiels. Placez les rondelles en acier inoxydable sur chaque tranche individuelle. Assurez-vous que les rondelles soient bien positionnés sur l'agarose entourant les tissus. Incuber la plaque de culture à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié avant d'être prêt à l'assiette des cellules T. 2. Isoler les cellules T des ganglions lymphatiques de souris Isoler les cellules T en fonction de l'article précédemment publié JoVE 3. Utiliser les cellules T immédiatement et passez à la section suivante. Sinon, les lymphocytes pourrait être cultivé pendant la nuit dans RPMI complet-milieu supplémenté avec 10 ng / ml d'IL-7. 3. Étiquetage des cellules T isolées Laver les cellules dans du HBSS. Les remettre en suspension dans le même tampon à 10 x 10 6 par ml. Ajouter le même volume de HBSS contenant 1 uM cellulaire Tracker verte CMFDA donnant une concentration finale de 0,5 uM. Incuber la suspension cellulaire à 37 ° C pendant 5 min. Laver les cellules deux fois avec RPMI complet et moyen terme. Resuspendre les cellules à une concentration finale de 10 x 10 6 par ml dans RPMI complet et moyen terme. Ces cellules marquées seront plaqués sur les tranches. Autres colorants fluorescents de CMFDA pourrait être utilisé aussi, mais gardez à l'esprit que ces molécules sont potentiellement toxiques au-dessus de certaines concentrations. 4. Placage étiquetés cellules T sur les tranches de ganglions lymphatiques Retirer l'excès moyennes contenues dans la partie intérieure de la rondelle avec une pipette. Ne laissez pas le tissu devient sèche; travailler rapidement pendant cette étape. Doucement passer 10 à 20 cellules T ul étiquetés qui correspond à 1 à 2 x 10 5 cellules dans la partie intérieure de la rondelle. Des précautions doivent être prises pour ne pas toucher le tissu avec la pointe de la pipette. Soyez sûr que la goutte de suspension cellulaire reste en place. Placer les tranches avec des cellules dans l'étuve à 37 ° C et 5% de CO 2 d'au moins 30 minutes pour permettre aux lymphocytes de migrer dans les tissus. 5. Imagerie des cellules T à l'intérieur des tranches de ganglions lymphatiques Dans cette vidéo, article, nous cellules T d'image fluorescente dans des tranches de ganglions lymphatiques avec un grand champ microscope inversé et un microscope confocal debout. Réglez la température à 37 ° C. Nos microscopes sont équipés de chambres à température contrôlée. Installer un système de perfusion permettant la perfusion continue de la tranche de ganglion lymphatique avec oxygénée (5% de CO 2, 95% d'O 2) rouge de phénol milieu RPMI sans. Dans notre système, perfusé des médias pénètre dans la chambre de l'imagerie d'un côté par la gravité. Le milieu est aspiré par une pompe reliée à un flacon de collecte des déchets. Réglez le débit des médias à 1 ml / min. Avec une pince fine, délicatement enlever la tranche de la plaque de 6 puits et tremper la préparation dans un milieu RPMI réchauffé oxygéné pendant quelques secondes pour se débarrasser des cellules fluorescentes pas infiltré dans le tissu. ImaGing cellules T avec un microscope à champ large inversé Placez la tranche à l'envers sur une chambre d'imagerie sur mesure qui se compose de fils de nylon collé sur la partie intérieure d'un plat à fond de verre. Dans cette chambre, le fils de nylon d'élever la tranche du verre et de permettre la solution oxygénée à diffuser dans les tissus. Ceci est nécessaire que la migration des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques est fortement dépendante de l'oxygène. Fixez la tranche en ajoutant sur lui une rondelle en acier inoxydable. Dans ces conditions, la tranche se situe à quelques microns au-dessus du fond du plat, ce qui facilite le renouvellement de la solution de perfusion. Pour capturer un grand champ de vision (800 x 800 um, environ un tiers de la surface de trancher le nœud), de recueillir des images en utilisant un objectif 10x à sec. Nous avons constaté que le 10x Nikon S Fluor 0,5 NA était le plus approprié pour nos analyses. Une expérience d'imagerie time-lapse typiques capte 5 avions optiques couvrant une profondeur totale de 50 um dans le sens axial (z) la dimension. Fluorescent des cellules T sont généralement imagée à des intervalles allant 10 à 30 secondes pendant 10 à 20 min. Imagerie des cellules T avec un microscope confocal debout Le microscope confocal utilisé dans ce protocole est un Leica SP5 équipé d'un objectif 20x immersion dans l'eau (l'Olympe, 20x/0.95 NA). Fixez la tranche à l'étape de l'imagerie du microscope. Remarque: En général, nous placer une rondelle sur la préparation pour l'immobiliser. Régler une session d'imagerie en recueillant une série d'images le long de l'axe z. Pour les cellules T d'image dans une structure de tissu intact, la position de départ est généralement fixé à 5 à 10 microns en dessous de la cellule T étiqueté premier. 6. Les résultats représentatifs En suivant cette vidéo-protocole vous devriez vous attendre à visualiser un grand nombre de cellules T fluorescentes accumulés dans la zone T du nœud, un phénomène qui se produit normalement dans cet environnement particulier in vivo (figure 1). En particulier, les cellules T doivent être exclus des zones de cellules B, qui sont généralement juste en dessous de la capsule. Une expérience réussie se traduira également par les lymphocytes T recrutés dans le tissu (figure 2), en affichant un comportement très mobiles (figure 3) cohérentes avec les résultats publiés obtenus dans les ganglions lymphatiques intactes 4. En moyenne, la vitesse moyenne de l'individu au sein de cellules T tranches devrait être proche de 10 um / min (figure 4). Figure 1. Les lymphocytes T s'accumulent dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T (CMFDA, vert) ont été ajoutés à un nœud lymphatique tranche 30 min avant l'acquisition d'image (photo du haut). L'image est la projection maximale de 5 images couvrant 50 microns dans la direction z. L'image en champ clair est indiqué en bas. Les images ont été capturées avec un microscope à champ large. Figure 2. Les cellules T sont recrutés dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T (CMFDA, vert) ont été ajoutés à un noeud lymphatique tranche de 30 minutes avant l'acquisition d'images en utilisant un microscope confocal. Les images ont été capturées à la surface de coupe (photo du haut) et 40 um ci-dessous (image du bas). Figure 3. Les cellules T sont très mobiles dans une tranche de ganglion lymphatique. Marqués à la fluorescence des cellules T ont été imagées pendant 12 min à l'aide d'un microscope à champ large. Trajectoires de cellules T individuelles sont affichées sous forme de couleur pistes pour représenter les déplacements croissante du bleu (faible cellules mobiles) au rouge (forte cellules mobiles). Pistes ont été calculés en utilisant le logiciel Imaris. La ligne blanche suit le bord du nœud, tandis que l'ovale pointillé délimite la zone B putatifs cellule. Figure 4. Dans une tranche de ganglion lymphatique, la vitesse des cellules T est proche de 10 um / min. Les vitesses ont été calculées en utilisant le logiciel à partir des pistes Imaris représenté dans la figure 3.