Экс естественных изображений Т-клеток у мышей фрагменты лимфатических узлов с Широкоугольные и конфокальной Микроскопы

1. Подготовка ломтики из лимфатических узлов Подготовка 4% низкой температурой плавления агарозы решение для вложения. Развести агарозы в ФБР и СВЧ этого решения. Когда агарозном полностью растворяется, поддерживать решения при 37 ° С до готовности к использованию. Подготовка 6-и культуре ткани пластины. Добавить 1,1 мл полной среды RPMI культуры на лунку, и вставьте органотипической фильтр в каждую лунку. Место 6-луночный планшет при 4 ° С до готовности передать ломтиками. Место шайб из нержавеющей стали, с внутренним диаметром 4 мм, в пластиковых блюдо заполнено RPMI полной среде. Шайбы будут в дальнейшем использоваться для концентрации клеток на vibratome часть разреза. Жертва мыши в соответствии с местными правилами содержания животных. Осторожно снимите периферических лимфатических узлов от окружающей ткани и поместите их в пластиковый блюдо с ледяным PBS. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить структуру лимфатических узлов, так как эти органы очень мягкий. Залить 4%-ном агарозном геле в 35-мм пластиковые тарелки и деликатно передачи узлов в гель. Оставьте агарозном геле на льду в течение 5 мин, чтобы укрепиться. Удалить блок из тарелки и отделка агар, чтобы оставить 3-5 мм геля вокруг каждого лимфатических узлов. Прикрепить вложенных узлов на образец диска vibratome с использованием нетоксичных ткань клеем. Установить образец диска в лотке со льдом, холодной PBS. Раздел агар-встроенные ткани на 320 мкм толщины с vibratome скорости установлен на медленном диапазоне (0,3 мм / с) и частоту колебаний установлен на средней дистанции (1,5 мм). Тщательно передачи ломтиками лимфатических узлов, как они сокращаются на органотипической вставками культуры с использованием тонких щипцов. Место 3 ломтика на каждой вставки. Использование большой осторожностью, как ломтики могут быть легко повреждены. Типичный периферических лимфатических узлов даст 5 секций при разрезании на 320 мкм. Откажитесь от первого и последнего ломтиками, так как они содержат только поверхностные ткани. Место шайб из нержавеющей стали на каждом отдельном срезе. Убедитесь в том, шайбы, хорошо позиционируется на агарозном окружающие ткани. Инкубируйте культуру пластины при температуре 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора увлажненный до готовности пластины Т-клеток. 2. Изоляция Т-клеток от мышей лимфатических узлов Изолировать Т-клеток в соответствии с ранее опубликованной статье Юпитер 3. Использование Т-клетки сразу и переходите к следующему разделу. В противном случае, лимфоциты могут быть культурным ночь в полной RPMI-среде с добавлением 10 нг / мл ИЛ-7. 3. Маркировка изолированных Т-клетки Вымойте клеток в HBSS. Ресуспендируют их в том же буфере при 10 х 10 6 на мл. Добавить такой же объем HBSS, содержащей 1 мкМ сотовый Tracker зеленый CMFDA давая конечной концентрации 0,5 мкМ. Инкубируйте клеточной суспензии при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Вымойте клетки в два раза с полной RPMI-среде. Ресуспендируют клеток в конечной концентрации 10 х 10 6 на мл в полной RPMI-среде. Эти меченые клетки будут покрыты на ломтики. Другие флуоресцентных красителей, чем CMFDA может быть использован тоже, но имейте в виду, что эти молекулы являются потенциально токсичными выше определенных концентраций. 4. Покрытие помечены Т-клеток на ломтики лимфатических узлов Удалите излишки средой, содержащиеся в внутренней части шайбы с пипеткой. Не позволяйте ткани становятся сухими, работают быстро на этом этапе. Аккуратно обойтись от 10 до 20 мкл меченых Т-клеток, что соответствует 1 до 2 х 10 5 клеток на внутренней части стиральной машины. Необходимо соблюдать осторожность и не прикасайтесь к ткани с кончика пипетки. Будьте уверены, что капля суспензии клеток остается на месте. Место срезов клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы лимфоциты мигрируют в ткани. 5. Изображений Т-клеток в лимфатических узлах ломтиками В этом видео-статьи, мы флуоресцентные изображения Т-клеток в лимфатических узлах ломтики широкопольных инвертированного микроскопа и конфокальной прямой микроскоп. Установите температуру на 37 ° C. Наши микроскопы оснащены регулируемой температурой камеры. Установить перфузии система, позволяющая непрерывной перфузии ломтик лимфатических узлов с кислородом (5% CO 2, 95% O 2) фенола красного среде без RPMI. В нашей системе перфузии СМИ входит в изображение камеры с одной стороны, под действием силы тяжести. Среды атмосферный с насос, подключенный к колбе сбора отходов. Установите частоту рабочих сред до 1 мл / мин. С тонкой пинцетом, осторожно вынуть часть из 6-луночного планшета и падения подготовки в подогретом кислородом RPMI среду в течение нескольких секунд, чтобы избавиться от флуоресцентных клетки не проникла в ткань. ИмаГинг Т-клеток с широким полем инвертированного микроскопа Место среза вверх тормашками на заказ изображений камеру, которая состоит из нейлона темы наклеиваются на внутреннюю часть блюдо стеклянным дном. В этой камере, нейлон темы поднять часть из стекла и позволяют кислородом решение диффундируют в ткани. Это необходимо, как Т-клеток миграции в лимфатические узлы сильно зависит от кислорода. Безопасные срез, добавив на него шайбу из нержавеющей стали. В этих условиях часть лежит несколько микрон над дном тарелку, которая способствует обновлению перфузии раствором. Чтобы захватить большое поле зрения (800 х 800 мкм, примерно треть срез поверхности узла), собирать изображения, используя 10-кратный объектив сухой. Мы обнаружили, что 10-кратный Nikon S фтора 0,5 Н.А. была наиболее подходящей для нашего анализа. Типичный покадровой визуализации эксперимент захватывает 5 оптических самолетов охватывающей общей глубиной 50 мкм в осевом (г) измерение. Флуоресцентные Т-клетки, как правило, отображаемого с интервалами от 10 до 30 секунд, в течение от 10 до 20 мин. Изображений Т-клеток с конфокальной прямой микроскоп Конфокальной микроскопии, используемые в настоящем протокол Leica SP5 оснащена 20-кратным погружения в воду цель (Olympus, 20x/0.95 NA). Безопасные квант изображения столик микроскопа. Примечание: Мы обычно помещают шайбу на подготовку, чтобы обездвижить его. Установить изображений сессии, собирая серии изображений по оси. Чтобы создать образ Т-клеток в нетронутой структуру ткани, исходное положение, как правило, установлен на уровне от 5 до 10 мкм ниже первого помечены Т-клеток. 6. Представитель результаты Следуя этой видео-протокол, который вы должны ожидать, чтобы визуализировать большое количество Т-клеток, люминесцентные, накопленных в Т зоне узла, явление, которое обычно происходит в этой конкретной среды в естественных условиях (рис. 1). В частности, Т-клетки должны быть исключены из зоны B клетки, которые обычно как раз под капсулой. Успешный эксперимент также приведет к Т-клетки призыву в ткани (рис. 2), показывая очень подвижны поведения (рис. 3) в соответствии с опубликованными результатами, полученные в нетронутой лимфатических узлов 4. В среднем, средняя скорость отдельных Т-клеток в ломтиков должна быть близка к 10 мкм / мин (рис. 4). Рисунок 1. Т-клетки накапливаются в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клеток (CMFDA, зеленый) были добавлены к ломтик лимфатических узлов за 30 минут до получения изображения (верхний рисунок). Изображение максимальный выступ 5 изображений охватывающих 50 мкм в направлении оси Z.. Яркий образ поля приведена на дно. Изображения были захвачены с помощью микроскопа широкопольных. Рисунок 2. Т-клетки вербуют в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клеток (CMFDA, зеленый) были добавлены к ломтик лимфатических узлов за 30 минут до получения изображения использованием конфокальной микроскопии. Изображения были захвачены на поверхности разреза (верхний рисунок) и 40 мкм ниже (нижний рисунок). Рисунок 3. Т-клетки чрезвычайно подвижны в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клетки были обследованы в течение 12 мин с использованием микроскопа широкопольных. Траектории отдельных клеток Т отображаются в виде цветных треков представляют увеличения смещения от синего (низкая подвижных клеток) до красного (высокий подвижных клеток). Треки были рассчитаны с использованием Imaris программного обеспечения. Белая линия следующим край узла, в то время как пунктирные овальной разграничивает зоны предполагаемого клеток. Рисунок 4. В ломтик лимфатических узлов, скорость Т-клеток, близка к 10 мкм / мин. Скорости были рассчитаны с использованием программного обеспечения от Imaris треки представлены на рисунке 3.