La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal
概要
La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser dirigida de las células de la nefrona renal en el riñón del embrión de pez cebra, o pronefros. Nuestro nuevo método puede ser utilizado para complementar la nefrotoxicidad inducida por los modelos de IRA y obtener un conocimiento de alta resolución de la célula y las alteraciones moleculares que están asociados con la regeneración del epitelio de la nefrona renal.
Abstract
La lesión renal aguda (IRA) se caracteriza por altas tasas de mortalidad de deterioro de la función renal durante un período de horas o días que culmina en insuficiencia renal 1. AKI puede ser causada por una serie de factores, incluyendo la isquemia, las drogas basadas en la toxicidad o lesiones obstructivas 1. Esto se traduce en una incapacidad para mantener la homeostasis de fluidos y electrolitos. Mientras AKI se ha observado durante décadas, a partir terapias clínicas aún no se han desarrollado. Curiosamente, algunos pacientes con lesión renal aguda recuperar la función renal con el tiempo, un fenómeno misterioso que sólo se ha caracterizado rudimentally 1,2. La investigación que utiliza modelos de mamíferos de la IRA ha demostrado que los riñones isquémicos o nefrotoxina heridos-experiencia de la muerte de las células epiteliales de los túbulos nefrona 1,2, las unidades funcionales del riñón que se componen de una serie de áreas especializadas (segmentos) de tres tipos de células epiteliales . Dentro de las nefronas, la muerte de las células epiteliales es mayor en las células del túbulo proximal. Hay evidencia que sugiere que la destrucción celular es seguido por desdiferenciación, proliferación y migración de las células epiteliales circundantes, que pueden regenerar completamente la nefrona 1,2. Sin embargo, hay muchas preguntas sin respuesta acerca de los mecanismos de la regeneración del epitelio renal, que van desde las señales que modulan estos eventos a los motivos de la amplia variedad de habilidades entre los seres humanos para regenerar riñones lesionados.
La larvas de pez cebra ofrece un excelente modelo para estudiar la regeneración del epitelio renal como su riñón pronephric se compone de nefronas que se conservan en los vertebrados superiores, incluyendo mamíferos 4,5. Las nefronas de las larvas de pez cebra se pueden visualizar con técnicas de fluorescencia debido a la relativa transparencia de los jóvenes pez cebra 6. Esto proporciona una oportunidad única de celda de la imagen y los cambios moleculares en tiempo real, en contraste con los modelos de mamíferos, donde nefronas son inaccesibles porque los riñones son sistemas estructuralmente complejos interiorizarse dentro del animal. Estudios recientes han utilizado la gentamicina aminoglucósidos como un agente tóxico causante de estudio de la lesión renal aguda e insuficiencia renal posterior: la gentamicina y otros antibióticos se ha demostrado que causan IRA en los seres humanos, y los investigadores han formulado métodos para utilizar este agente para provocar daño a los riñones en el pez cebra 7 , 8. Sin embargo, los efectos de la toxicidad de los aminoglucósidos en las larvas de pez cebra son catastróficos y mortales, que presenta una dificultad en el estudio de la regeneración epitelial y función en el tiempo. Nuestro método se presenta el uso de la ablación de células específicas como una nueva herramienta para el estudio de la lesión epitelial en el pez cebra. La ablación con láser ofrece a los investigadores la capacidad de inducir la muerte celular en una población limitada de las células. Otros campos de las células pueden ser escogidos en base a la ubicación morfológica, la función, o incluso la expresión de un fenotipo celular particular. Por lo tanto, la ablación por láser aumentar la especificidad de lo que los investigadores pueden estudiar, y puede ser un enfoque nuevo y poderoso para arrojar luz sobre los mecanismos de regeneración del epitelio renal. Este protocolo se puede aplicar ampliamente a llegar a las poblaciones de células en otros órganos en el embrión de pez cebra para el estudio y la regeneración de lesiones en cualquier número de contextos de interés.
Protocol
Discussion
El pez cebra es un organismo modelo ampliamente utilizado en muchos aspectos de la ciencia, las aplicaciones de las que están creciendo 6. El empleo del sistema de modelo de pez cebra en el estudio de enfermedades renales como la IRA ha llevado a importantes observaciones y seguirá siendo un buen modelo para estudiar la lesión renal 7,8. Con un genoma que se ha secuenciado y muchos protocolos moleculares en su lugar, se ha convertido cada vez más fácil para llevar a cabo la investigación que utiliza pez cebra sofisticados modelos transgénicos, derribo y estudios de genética misexpression. El pez cebra tiene un ciclo vital corto con un tamaño de la generación de grandes y bien definidas las etapas de desarrollo. Además, las etapas de embriones y larvas de pez cebra son en gran medida transparente, por lo que los estudios de imagen posible sin la disección del organismo. A lo largo de las etapas embrionarias y larvas, el pez cebra tiene un riñón pronephric compone de dos nefronas, que siguen siendo visibles en estos puntos de tiempo de desarrollo. Pez cebra nefronas pronephric son análogos en estructura y función a sus homólogos de los mamíferos, por lo que es un buen modelo para estudios de toxicidad aguda insuficiencia renal 4,5.
El riñón es crucial para la supervivencia de los seres humanos y otros vertebrados, que actúa como el órgano que limpia el cuerpo de los desechos metabólicos líquido. Esta función de limpieza se basa en la capacidad de las nefronas del riñón para filtrar la sangre, y luego modificar el filtrado para recoger los desechos nitrogenados en la secreción y al mismo tiempo mantener el equilibrio de líquidos y electrolitos. Nefronas se componen de un filtro de la sangre, los túbulos epiteliales, y la fuga en un conducto. La integridad estructural y funcional de las tres partes es esencial para la función de nefronas. Diversos insultos a los riñones, incluyendo la exposición a nefrotoxinas, la isquemia, o la obstrucción del tracto de salida urinaria puede dar lugar a un IRA. La patología de la lesión renal aguda se asocia a menudo con 1,2 necrosis tubular aguda. Los estudios clínicos han demostrado que el consiguiente insuficiencia renal tiene una mortalidad que puede oscilar entre 7-80% dependiendo de la causa y el contexto de la insuficiencia renal. Sin embargo, el diagnóstico rápido y la inversión de la causa subyacente de la IRA es cada vez más asociado con la recuperación a través de la regeneración de los túbulos nefrona necrótico. Recientes estudios de mapeo destino han demostrado que la población de células grandes que vuelve a llenar dañado túbulos nefrona son las células epiteliales que se originan en las áreas adyacentes, sin lesiones 12. Estos hallazgos no han eliminado la posibilidad de que renal células madre / progenitoras pueden participar en el proceso, y los informes independientes han sugerido que las células derivadas de médula ósea pueden contribuir a la regeneración renal 13. Está claro que continuaban las investigaciones son necesarias para resolver mejor las fuentes celulares de la regeneración del epitelio renal.
Tanto la regeneración y el desarrollo de nefronas comparten el fenómeno de los interruptores en el estado entre los fenotipos celulares mesenquimales y epiteliales. Durante el desarrollo de nefronas, las células mesenquimales precursoras se diferencian en un fenotipo fijas, correspondientes a una membrana basal para formar el epitelio tubular 3. El fenómeno migratorio especulado de las células epiteliales después de la insuficiencia renal aguda requiere una desdiferenciación en un fenotipo mesenquimal. Curiosamente, los estudios recientes sugieren que las células mesenquimales en los riñones dañados presentan un perfil de expresión similar a la de las células mesenquimales en el desarrollo 14. Varios informes han detectado cambios en las moléculas de adhesión celular, proteínas de la matriz, citocinas y quimiocinas. A raíz de la propuesta para la transición mesenquimal epitelial, las células montamos sobre una membrana basal tubular y reiniciar las actividades del epitelio. La determinación de los genes importantes en este proceso sigue siendo un tema de investigación de nuestro laboratorio y otros. Gran parte del trabajo para dilucidar los factores clave en este proceso que queda por hacer, pero los avances significativos en el campo ha sido anunciada por el estudio de los efectos de la gentamicina.
AKI y fallo renal causado por la gentamicina es relevante teniendo en cuenta la prevalencia de los compuestos nefrotóxicos utilizados en la medicina 15. Se utiliza como un tratamiento para gram-negativos infecciones bacterianas, la administración de aminoglucósidos conduce a una lesión aguda en el 10-25% de los casos. La droga causa una gran cantidad de efectos negativos sobre el celular, así que resulta en la apoptosis o necrosis en muchas células tubulares. Los estudios han encontrado que la droga se unen preferentemente a un complejo formado por megalina y cubulin que está involucrado en la endocitosis. Estas moléculas se encuentran en abundancia en las células epiteliales del túbulo proximal, aunque no se limitan a la expresión en estas células. A través de la señalización celular que resulta en la inducción de estrés oxidativo, la liberación de vasoconstrictores, el agotamiento de ATP celular, la hipoxia, la inhibición de las fosfolipasas, los antibióticos gentamicina y similares causanapoptosis y necrosis en las células epiteliales. Además, los antibióticos desencadenar la contracción mesangial en la sangre nefrona filtro (glomérulos), lo que resulta en una caída en la tasa de filtración glomerular y negativamente alterando la capacidad del riñón para filtrar la sangre. La producción de especies reactivas del oxígeno, moléculas inmunoestimulantes, y la activación de las fosfolipasas tienen efectos difusos en la nefrona, la creación de una catastrófica patología que lleva a la insuficiencia renal aguda.
Mientras que los estudios con antibióticos gentamicina y similares han sido y seguirán siendo herramientas importantes para la investigación renal regeneración, carecen de una precisión que puede ser útil en el tratamiento de determinadas cuestiones. Nuestro sistema de usar el pez cebra, junto con un método de ablación láser se describe en este protocolo responde a la necesidad de una herramienta de investigación precisa. La ablación con láser permite a los investigadores para inducir la destrucción de las células en las áreas focales del túbulo renal, que van desde una pequeña (2-3) a grandes (> 50 a 100) la población, con una precisión inigualable. En este protocolo, utilizamos un método previamente desarrollado de la exposición a dextrano conjugados para etiquetar preferentemente poblaciones túbulo proximal del epitelio. Por otra parte, el pez cebra transgénico líneas que expresan la proteína verde fluorescente en una o más regiones del túbulo se podrían utilizar. Por ejemplo, cadherin17: eGFP pez cebra transgénico presentan fluorescencia fuerte en las regiones del túbulo distal (aunque débil en las poblaciones proximal), y podría ser valiosa para los estudios de regeneración en los segmentos de los túbulos otros 16. La visibilidad de la nefrona permitirá lapso de tiempo de grabación de vídeo de los cambios celulares en el tiempo. Cuando se combina con estudios de expresión génica, tales como montar toda la hibridación in situ o inmunohistoquímica, los investigadores pueden detectar alteraciones moleculares en la nefrona en el tiempo. En conjunto, estas estrategias se pueden empezar a formular una comprensión más dinámica de los acontecimientos que suceden en las células epiteliales renales son destruidos.
La principal advertencia de nuestro modelo de ablación con láser es que puede recapitular aspectos parciales de las condiciones fisiológicas que suceden en humanos AKI. La muerte celular inducida por los daños físicos instantánea es diferente de la cascada de eventos que conduce a la necrosis de las células, y como tal, los factores humorales en estos microambientes diferentes no pueden ser idénticos. Además, existe evidencia de la apoptosis inducida durante el daño renal, y no se sabe si tales consecuencias transpirar insulto siguientes con un láser. Sin embargo, al igual que el cultivo celular es una herramienta que mejor responde a algunas preguntas que requieren un entorno muy controlado, la ablación por láser servirá como un muy controlado en el modelo in vivo de la IRA. Por lo tanto, las percepciones recogidas de estudios de la ablación renal epitelial en el pez cebra es probable que promueven el descubrimiento de las ideas fundamentales que se pueden aplicar a las investigaciones de otras lesiones renales y, potencialmente, para crear un mejor diagnóstico en seres humanos.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wingert útil para los debates de la biología y las técnicas de AKI pez cebra, y Diep C. por compartir su receta de metilcelulosa. Los autores también desean expresar nuestra gratitud a los miembros del personal del Centro de Notre Dame para la Investigación de pez cebra para proporcionar una excelente atención permanente para la cría de nuestra colonia de pez cebra. La financiación del premio NIH NIDDK conceder DK083512 y de laboratorio generosa financiación inicial de la Universidad de Notre Dame, apoya este trabajo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Methylcellulose | Sigma | M0262 |
| Depression slide | Fisher | S175201 |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
参考文献
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