Laser Ablatie van de zebravis Pronephros renale epitheliale regeneratie Study

De zebravis is een veel gebruikt model organisme in heel veel aspecten van de wetenschap, zijn de toepassingen van die groeiende ^6. De inzet van de zebravis modelsysteem voor de studie van nierziekten, zoals AKI heeft geleid tot belangrijke observaties en blijft een goed model om nierschade ^7,8 studie. Met een genoom dat is gesequenced en vele moleculaire protocollen, is het steeds gemakkelijker om geavanceerde zebravis onderzoek dat transgene modellen, gen knock-down en misexpression studies maakt gebruik van uit te voeren. De zebravis heeft een korte levenscyclus met grote generatie maten en goed gedefinieerde ontwikkelingsstadia. Bovendien is de zebravis embryonale en larvale stadia zijn grotendeels transparant, waardoor imaging studies mogelijk zonder dissectie van het organisme. Gedurende de embryonale en larvale stadia, de zebravis heeft een pronephric nier bestaat uit twee nefronen, die zichtbaar blijven tijdens deze ontwikkeling tijdstippen. Zebravissen pronephric nefronen zijn analoog in structuur en functie van hun collega's van zoogdieren, waardoor het een goed model voor acuut nierfalen studies ^4,5.

De nier is cruciaal voor het voortbestaan ​​van de mens en andere gewervelde dieren, die als het orgaan dat het lichaam van vloeibare metabolische afvalstoffen reinigt. Deze reinigende functie berust op het vermogen van de nier nefronen om het bloed te filteren, en wijzig vervolgens het filtraat stikstofhoudende afvalstoffen voor afscheiding te verzamelen en tegelijkertijd te onderhouden vocht-en elektrolytenbalans. Nefronen bestaan ​​uit een bloed-filter, epitheliale tubulus, en monden uit in een kanaal. De structurele en functionele integriteit van alle drie de onderdelen is een integraal onderdeel van nefron functie. Diverse beledigingen naar de nieren, met inbegrip van de blootstelling aan nephrotoxins, ischemie, of obstructie van de urine-uitstroom stukken kan resulteren in ^een AKI. De pathologie van de AKI wordt vaak geassocieerd met acute tubulaire necrose ^1,2. Klinische studies hebben aangetoond dat de daaruit voortvloeiende nierinsufficiëntie een sterftecijfer dat overal kan 7-80% bereik afhankelijk van de oorzaak en de context van het nierfalen. Echter, is een snelle diagnose en omkering van de onderliggende oorzaak van AKI in toenemende mate geassocieerd met terugwinning via de regeneratie van de necrotische nefron tubuli. Recente lot in kaart brengen van studies hebben aangetoond dat de grote populatie cellen die beschadigd zijn nefron tubuli repopulates zijn epitheelcellen die voortkomen uit aangrenzende, ongedeerd gebieden ^12. Deze bevindingen hebben niet de mogelijkheid uitgesloten dat een nier-stam / voorlopercellen kunnen deelnemen aan het proces, en onafhankelijke rapporten hebben gesuggereerd dat het beenmerg afkomstige cellen kunnen bijdragen aan nier-regeneratie ^13. Het is duidelijk dat de aanhoudende onderzoeken zijn nodig om beter op te lossen cellulaire bronnen van nier-epitheliale regeneratie.

Zowel nefron herstel en ontwikkeling deel het fenomeen van de schakelaars in cellulaire toestand tussen mesenchymale en epitheliale fenotypes. Tijdens de nefron ontwikkeling, mesenchymale stamcellen differentiëren tot een stationaire fenotype, verbonden aan een kelder membraan naar de tubulair epitheel ³ te vormen. De gespeculeerd verschijnsel migratie van epitheelcellen na acuut nierfalen noodzakelijk een dedifferentiatie naar een mesenchymale fenotype. Interessant, recente studies suggereren dat mesenchymale cellen in beschadigde nieren een uitdrukking profiel vergelijkbaar met mesenchymale cellen tijdens de ontwikkeling ¹⁴ vertonen. Diverse rapporten hebben gedetecteerd dat veranderingen in de cel adhesie moleculen, matrix eiwitten, cytokines en chemokines. Na de voorgestelde mesenchymale aan epitheliale overgang, cellen weer in elkaar zetten op een basaal membraan en herstart tubulaire epitheliale activiteiten. Het bepalen van de genen die belangrijk zijn in dit proces is nog steeds een onderwerp van onderzoek voor ons lab en anderen. Veel van het werk om de belangrijkste factoren in dit proces toe te lichten nog gedaan moet worden, maar belangrijke vooruitgang in het veld is aangekondigd door de studie van de effecten van gentamicine.

AKI en nierfalen ten gevolge van gentamicine is relevant gezien de prevalentie van nefrotoxische verbindingen gebruikt in de geneeskunde ^15. Gebruikt als een behandeling voor gram-negatieve bacteriële infecties, de toediening van aminoglycosiden leidt tot een acuut letsel in 10-25% van de gevallen. De drug veroorzaakt een overvloed aan negatieve cellulaire effecten, samen resulterend in apoptose of necrose in vele tubulaire cellen. Studies hebben gevonden de drug om bij voorkeur te binden aan een complex gevormd wordt door megalin en cubulin dat betrokken is bij endocytose. Deze moleculen zijn te vinden in overvloed in epitheelcellen van de proximale tubulus, hoewel ze zijn niet beperkt tot expressie in deze cellen. Door middel van cellulaire signalering resulteert in inductie van oxidatieve stress, release van vasoconstrictoren, uitputting van cellulaire ATP, hypoxie, remming van fosfolipasen, gentamicine en soortgelijke antibiotica veroorzakenapoptose en necrose in epitheliale cellen. Bovendien, antibiotica veroorzaken mesangiale krimp in het nefron bloed filter (glomerulus), wat resulteert in een daling van de glomerulaire filtratiesnelheid en een negatieve wijziging van het vermogen van de nieren het bloed te filteren. De productie van reactieve zuurstof species, immunostimulerende moleculen, en activering van fosfolipasen hebben diffuse effecten in het nefron, het creëren van een katastrofisch pathologie die leidt tot acuut nierfalen.

Terwijl gentamicine en soortgelijke antibiotica studies zijn en blijven belangrijke hulpmiddelen zijn voor nier-regeneratie onderzoek, ze missen een precisie die nuttig kan zijn bij het aanpakken van bepaalde vragen. Ons systeem van het gebruik van de zebravis in combinatie met een laser ablatie methode beschreven in dit protocol voorziet in de behoefte van een dergelijke nauwkeurige research tool. Laser ablatie stelt onderzoekers in staat om cel destructie in concentratiegebieden van de niertubuli veroorzaken, variërend van een klein (2-3) tot groot (> 50-100) populaties, met ongeëvenaarde precisie. In dit protocol maken we gebruik van een eerder ontwikkelde methode van de blootstelling aan dextran-conjugaten om bij voorkeur label proximale tubulus epitheel populaties. Als alternatief zou transgene zebravis lijnen die groen fluorescerend eiwit tot expressie in een of meer regio's van de tubulus worden gebruikt. Bijvoorbeeld, cadherin17: eGFP transgene zebravis vertonen sterke fluorescentie in de distale tubuli regio's (hoewel zwak in proximale populaties), en kan waardevol zijn voor studies van de regeneratie in andere segmenten tubuli ^16. De zichtbaarheid van het nefron in staat zal stellen time-lapse video-opname van de cellulaire veranderingen in de tijd. In combinatie met genexpressie studies zoals ganse berg in situ hybridisatie of immunohistochemie, kunnen onderzoekers ontdekken moleculaire veranderingen in het nefron in de tijd. Bij elkaar genomen, kunnen dergelijke strategieën beginnen met een meer dynamische begrip van de gebeurtenissen die zweten bij het renale epitheelcellen worden vernietigd te formuleren.

De grote valkuil van onze laser ablatie model is dat het kan recapituleren deelaspecten van de fysiologische omstandigheden die tot uiting komen in de menselijke AKI. De celdood geïnduceerd door onmiddellijk fysieke schade is verschillend van de cascade van gebeurtenissen die tot necrose leidt in de cellen, en als zodanig de humorale factoren in deze verschillende micro-omgevingen kunnen niet identiek zijn. Daarnaast bestaat er het bewijs van apoptose geïnduceerd tijdens de nieren letsel, en het is niet bekend of deze gevolgen na belediging zweten met een laser. Echter, net zoals celkweek is een instrument dat beter beantwoordt een aantal vragen die een sterk gecontroleerde omgeving nodig, laser ablatie zal dienen als een uiterst gecontroleerde in vivo model van de AKI. Als zodanig, de inzichten vergaard van nier-epitheliale ablatie studies in zebravis zal waarschijnlijk te bevorderen ontdekking van de fundamentele inzichten die kunnen worden toegepast om onderzoeken van andere nier verwondingen en eventueel gebruikt worden om een ​​betere diagnose te creëren bij de mens.