Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration
概要
Akute Nierenschädigung (AKI) in den Menschen ist ein bekanntes klinisches Problem durch eine Schädigung der Epithelzellen, die Nieren Nephrone umfassen verursacht und AKI ist mit hohen Sterblichkeitsraten von 50-70% 1 verbunden. Nach epithelialen Zell-Zerstörung, haben Nephronen eine begrenzte Fähigkeit zur Regeneration, obwohl die Mechanismen und Einschränkungen, die dieses Phänomen Führung schlecht bleiben verstanden. In diesem Video-Beitrag beschreiben wir unsere Technik für die gezielte Laser-Ablation von Nieren Nephron Zellen in der Zebrafisch-Embryos Niere oder Vorniere. Unsere neue Methode kann verwendet werden, um Nephrotoxizität-induzierte Modelle der AKI ergänzen und gewinnen Sie einen hochauflösenden Verständnis der Zell-und molekulare Veränderungen, die mit Epithelregeneration in der Niere Nephron verbunden sind.
Abstract
Akute Nierenschädigung (AKI) ist durch eine hohe Sterblichkeitsrate von einer Verschlechterung der Nierenfunktion über einen Zeitraum von Stunden oder Tagen, bei Nieren-Fehler 1 gipfelt aus. AKI kann durch eine Reihe von Faktoren, einschließlich Ischämie, medikamentöse Toxizität oder obstruktiver Körperverletzung 1 verursacht werden. Dies führt zu einer Unfähigkeit, Flüssigkeits-und Elektrolyt-Homöostase aufrecht zu erhalten. Während AKI ist seit Jahrzehnten beobachtet, über wirksame klinische Therapien erst noch entwickelt werden. Interessanterweise wieder einige Patienten mit AKI Nierenfunktion im Laufe der Zeit, eine mysteriöse Phänomen, das nur ansatzweise hat 1,2 charakterisiert. Forschung mit Säugetieren Modelle der AKI hat gezeigt, dass ischämische oder Nephrotoxin-verletzten Nieren Epithelzelle Todeserfahrung in Nephron Tubuli 1,2, die funktionellen Einheiten der Niere, die sich aus einer Reihe von spezialisierten Regionen (Segmente) der epithelialen Zelltypen 3 sind gemacht . Innerhalb Nephrone ist epithelialen Zelltod höchsten in proximalen Tubuluszellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Zellzerstörung durch Dedifferenzierung, Proliferation und Migration von umgebenden Epithelzellen, die das Nephron regenerieren kann ganz 1,2 befolgt wird suggeriert. Allerdings gibt es viele unbeantwortete Fragen über die Mechanismen der renalen epithelialen Regeneration, angefangen von den Signalen, die diese Ereignisse modulieren, die Gründe für die breite Variation der Fähigkeiten von Mensch zu Mensch verletzt Nieren regenerieren.
Die Larven Zebrafisch bietet ein hervorragendes Modell, um Nieren Epithelregeneration Studie als pronephric Niere Nephronen, dass bei höheren Wirbeltieren, einschließlich Säugetieren 4,5 konserviert sind zusammengesetzt ist. Die Nephrone mit Zebrabärblingembryonen visualisiert werden können mit der Fluoreszenz-Techniken wegen der relativen Transparenz des jungen Zebrafisch 6. Dies bietet eine einzigartige Gelegenheit, Bildzelle und molekularen Veränderungen in Echtzeit, im Gegensatz zu Säugetieren Modelle, bei denen Nephrone sind unzugänglich, weil die Nieren strukturell komplexen Systemen innerhalb des Tieres internalisiert werden. Jüngste Studien haben das Aminoglykosid Gentamycin als toxische Erreger für das Studium der AKI und anschließende Nierenversagen eingesetzt: Gentamicin und andere Antibiotika haben gezeigt, dass AKI beim Menschen verursachen, und Forscher haben Methoden entwickelt, um dieses Anbieters nutzen, um Nierenschäden im Zebrafisch 7 auslösen , 8. Allerdings sind die Effekte von Aminoglykosid-Toxizität in Zebrafisch-Larven katastrophal und tödlich, die eine Schwierigkeit stellt bei der Untersuchung epithelialen Regeneration und Funktion im Laufe der Zeit. Unsere Methode stellt der Einsatz von gezielten Zellablation als neuartiges Werkzeug für die Untersuchung von epithelialen Verletzungen im Zebrafisch. Laser-Ablation gibt Forschern die Möglichkeit, den Zelltod in einer begrenzten Population von Zellen zu induzieren. Unterschiedliche Bereiche der Zellen können auf der Basis morphologischer Standort, Funktion, oder sogar die Expression eines bestimmten zellulären Phänotyp ausgerichtet sein. So werden Laser-Ablation Erhöhung der Spezifität von dem, was Forscher studieren können, und kann ein leistungsstarker neuer Ansatz, um Licht auf die Mechanismen der renalen Epithelregeneration vergossen werden. Dieses Protokoll kann im Großen und Ganzen angewendet werden, um Zellpopulationen in anderen Organen im Zebrafisch-Embryos, um Verletzungen und Regeneration in einer beliebigen Anzahl von Zusammenhängen von Interesse Studie Ziel.
Protocol
Discussion
Der Zebrafisch ist ein weit verbreitetes Modell-Organismus in vielen Aspekten von Wissenschaft, sind die Anwendungen, von denen immer 6. Der Einsatz des Zebrafisch-Modell-System in der Studie von Nierenerkrankungen wie der AKI hat wichtige Beobachtungen geführt und wird auch weiterhin ein gutes Modell, um Nierenschäden 7,8 studieren. Mit einem Genom, das sequenziert wurde und viele molekulare Protokolle vorhanden, wird es immer einfach zu hoch Zebrafisch-Forschung, dass transgene Modelle, Gen-Knockdown und misexpression Studien nutzt durchzuführen. Der Zebrafisch hat einen kurzen Lebenszyklus mit großen Generation Größen und gut definierten Entwicklungsstadien. Darüber hinaus sind die Zebrafisch-Embryonen und Larven weitgehend transparent, so dass bildgebende Verfahren möglich, ohne Dissektion des Organismus. Während embryonale und Larvenstadien, hat der Zebrafisch ein pronephric Niere von zwei Nephronen, die sichtbar in diesen Entwicklungs-Zeitpunkten bleiben bestehen. Zebrafisch pronephric Nephrone sind analog der Struktur und Funktion, um ihre Kollegen von Säugetieren, so dass es ein gutes Modell für akutes Nierenversagen Studien 4,5.
Die Niere ist entscheidend für das Überleben von Menschen und anderen Wirbeltieren, die als das Organ, das dem Körper Flüssigkeit Stoffwechselschlacken reinigt. Dieses reinigende Funktion beruht auf der Fähigkeit der Niere Nephronen, um das Blut filtern, und ändern Sie dann das Filtrat stickstoffhaltigen Abfälle für die Sekretion zu sammeln und gleichzeitig pflegen Flüssigkeits-und Elektrolythaushalt. Nephron sind von einer Blut-Filter-, Epithel-Tubulus, und Drain in einen Kanal zusammen. Die strukturelle und funktionelle Integrität aller drei Teile ist ein integraler Bestandteil Nephron Funktion. Verschiedene Beleidigungen auf die Niere, einschließlich der Exposition gegenüber nephrotoxins, Ischämie oder Verschluss der ableitenden Abfluss Verträge können in AKI 1 Ergebnis. Die Pathologie der AKI wird oft mit akuter tubulärer Nekrose 1,2 verbunden. Klinische Studien haben gezeigt, dass daraus Nierenversagen hat eine Sterblichkeitsrate, die irgendwo im Bereich von 7 bis 80% kann je nach Ursache und Kontext der Niereninsuffizienz. Allerdings ist eine schnelle Diagnose und Umkehr der zugrunde liegende Ursache der AKI zunehmend mit Rückgewinnung über die Regeneration der nekrotischen Nephron Tubuli assoziiert. Aktuelle Schicksal Mapping-Studien haben gezeigt, dass die großen Zellpopulation, die beschädigt Nephron Tubuli füllt Epithelzellen, die von benachbarten, unverletzten Bereichen 12 stammen, werden. Diese Erkenntnisse haben nicht die Möglichkeit, dass die renale Stammzellen / Vorläuferzellen können in dem Prozess zu beteiligen eliminiert und unabhängige Berichte lassen vermuten, dass Knochenmark-abgeleiteten Zellen kann zu einer Niereninsuffizienz Regeneration 13 zu fördern. Es ist klar, dass die weitere Untersuchungen erforderlich sind, um besser zu lösen zellulären Quellen der renalen epithelialen Regeneration.
Beide Nephron Regeneration und Entwicklung teilen sich die Erscheinung der Schalter in der zellulären Zustand zwischen mesenchymalen und epithelialen Phänotyp. Während Nephron Entwicklung, mesenchymalen Vorläuferzellen in eine stationäre Phänotyp differenzieren, Befestigung an einer Basalmembran, die Tubulusepithel 3 zu bilden. Die Spekulationen Migrationsphänomen von Epithelzellen folgenden akutem Nierenversagen erfordert eine Dedifferenzierung zu einem mesenchymalen Phänotyp. Interessanterweise deuten neuere Studien, dass mesenchymale Zellen in geschädigten Nieren ein Expressionsprofil ähnlich einer mesenchymalen Zellen während der Entwicklung 14 weisen. Verschiedene Berichte wurden Änderungen in Zelladhäsionsmoleküle, Matrixproteine, Cytokine und Chemokine entdeckt. Nach der geplanten mesenchymalen zu epithelialen Übergangs-Zellen auf einer Basalmembran wieder zusammenbauen und reinitiate tubulären Epithelzellen Aktivitäten. Bestimmen die Gene wichtig in diesem Prozess weiterhin ein Thema der Forschung für unser Labor und andere. Ein Großteil der Arbeit auf die wichtigsten Faktoren in diesem Prozess klären bleibt noch zu tun, aber deutliche Fortschritte auf dem Gebiet wurde durch die Untersuchung der Auswirkungen von Gentamicin angekündigt worden.
AKI und Nierenversagen durch Gentamicin verursacht wird relevant in Anbetracht der Prävalenz von nephrotoxischen Verbindungen in der Medizin 15 verwendet. Wird als eine Behandlung für gram-negative bakterielle Infektionen, führt die Verwaltung von Aminoglykosiden zu akuten Verletzungen in 10-25% der Fälle. Das Medikament führt zu einer Fülle von negativen zelluläre Effekte zusammen was in Apoptose oder Nekrose in vielen Tubuluszellen. Studien haben das Medikament bevorzugt an ein komplexes durch Megalin und cubulin, dass in der Endozytose beteiligt ist gebildet gefunden. Diese Moleküle sind in Hülle und Fülle in den Epithelzellen des proximalen Tubulus gefunden, obwohl sie nicht darauf beschränkt, um die Expression in diesen Zellen sind. Durch zelluläre Signalwege führt die Induktion von oxidativem Stress, Freisetzung von Vasokonstriktoren, die Erschöpfung des zellulären ATP, Hypoxie, Hemmung der Phospholipasen bewirken Gentamicin und ähnliche AntibiotikaApoptose und Nekrose in Epithelzellen. Darüber hinaus auslösen Antibiotika mesangialen Kontraktion im Nephron Blutfilter (Glomerulus), was zu einem Abfall der glomerulären Filtrationsrate und negativ verändern die Fähigkeit der Niere in den Blutkreislauf zu filtern. Die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, immunstimulierende Moleküle, und die Aktivierung von Phospholipasen haben diffuse Effekte in das Nephron, die Schaffung eines katastrophalen Pathologie, die zu akutem Nierenversagen führt.
Während Gentamicin und ähnliche Antibiotika Studien wurden und werden auch weiterhin wichtige Werkzeuge für die Nieren Regeneration Forschung, fehlt es ihnen an einer Präzision, die nützlich für die Behebung bestimmter Fragen können. Unser System für die Verwendung der Zebrafisch in Verbindung mit einem Laser-Ablation-Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen Antworten die Notwendigkeit einer solchen präzisen Recherche-Tool. Laser-Ablation können die Forscher Zellzerstörung in Schwerpunkte der Nierentubuli zu induzieren, die von einem kleinen (2-3) bis groß (> 50-100) Populationen, mit unerreichter Präzision. In diesem Protokoll, nutzen wir eine zuvor entwickelte Methode der Exposition gegenüber Dextran-Konjugate bevorzugt Label proximalen Tubulus epithelialen Populationen. Alternativ könnte transgenen Zebrafisch Linien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren in einer oder mehreren Regionen des Röhrchens verwendet werden. Zum Beispiel, cadherin17: Ausstellung eGFP transgenen Zebrafisch starke Fluoreszenz im distalen Tubulus Regionen (obwohl schwach in proximalen Populationen) und könnte wertvoll sein für das Studium der Regeneration in anderen Tubulus Segmente 16. Die Sichtbarkeit des Nephron ermöglicht Zeitraffer-Video-Aufzeichnung von zellulären Veränderungen über die Zeit. Wenn es mit der Genexpression Studien wie whole mount in situ Hybridisierung oder Immunhistochemie gekoppelt, können die Forscher molekulare Veränderungen in das Nephron im Laufe der Zeit zu erkennen. Zusammen genommen können solche Strategien zu beginnen, um ein dynamischeres Verständnis der Ereignisse, die bei Nieren-Epithelzellen zerstört werden transpire formulieren.
Die großen Vorbehalt unserer Laser-Ablation-Modell ist, dass sie Teilaspekte der physiologischen Bedingungen, die im menschlichen AKI transpire rekapitulieren. Der Zelltod durch sofortige physische Schädigung induzierte unterscheidet sich von der Kaskade von Ereignissen, die zur Nekrose führt in den Zellen, und als solche die humoralen Faktoren in den verschiedenen Mikroumgebungen dürfen nicht identisch sein. Darüber hinaus gibt es Beweise für Apoptose bei Nierenversagen induziert wird, und es ist nicht bekannt, ob solche Folgen nach Beleidigung transpire mit einem Laser. Aber ebenso, wie der Zellkultur ist ein Werkzeug, bessere Antworten auf einige Fragen, die ein sehr kontrollierter Umgebung erfordern, Laser-Ablation wird als hoch in-vivo-Modell des AKI gesteuert dienen. Als solcher sammelte die Erkenntnisse aus Nierenepithelzellen Ablation Studien im Zebrafisch wird wahrscheinlich zu fördern Entdeckung der fundamentalen Erkenntnisse, die auf Untersuchungen von anderen renalen Verletzungen angewendet werden und können potenziell genutzt werden, um eine bessere Diagnostik in den Menschen zu schaffen.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder der Wingert-Labor für hilfreiche Diskussionen des AKI Biologie und Zebrafisch-Techniken und C. Diep für die gemeinsame Nutzung seiner Methylcellulose Rezept. Die Autoren möchten auch unseren Dank an die Mitarbeiterinnen und Mitarbeiter der Notre Dame-Zentrum für Zebrafisch Forschung für eine ausgezeichnete laufenden Tierhaltung Betreuung unserer Zebrafisch Kolonie auszudrücken. Mittel aus dem NIH-NIDDK Zuschussvergabe DK083512 und großzügige Labor Anschubfinanzierung von der University of Notre Dame, unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Embryo dishes | Falcon | 35-1005 |
| Dissection forceps | Roboz | RS-5010 |
| Injection needles | Sutter Intruments | BF100-50-10 |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Fisher | 204, 13-711-23 |
| Tricaine | Sigma | E10521 |
| Methylcellulose | Sigma | M0262 |
| Depression slide | Fisher | S175201 |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
参考文献
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