Dissectie van de Adult zebravis Kidney

1. Dissectie van de volwassen zebravis nier van een dier niet vastgelegde monster Kies een volwassen zebravissen tussen 3-6 maanden in leeftijd voor dissectie. Euthanaseren de vis door deze in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7.0 voor ongeveer 4-5 minuten, kijken voorzichtig om te zien dat de kieuwen stoppen met bewegen en het hart stopt met kloppen. Met behulp van een lepel, til de vis uit de tricaïne bad in een kleine hoeveelheid van de oplossing, giet de oplossing en voorzichtig het dier op een papieren handdoek. Gebruik een scherp paar van dissectie schaar aan de kop van het dier te verwijderen, het maken van een snede net achter de kieuw operculum (Figuur 1, pad A). Gooi het hoofd in een biologisch gevaarlijk afval container. Gebruik de dissectie schaar om het lichaam te openen van het dier, door het maken van een lange ventrale incisie, te beginnen met het hoofd en eindigt bij de staart aan de basis van de staartvin (figuur 1, pad B). Verwijder de interne organen van het dier met behulp van een paar van de dissectie pincet / tang, en plaats ze in biologisch gevaarlijk afval. Wees voorzichtig dat u de dorsale lichaamswand borstel, want dit is de locatie van de nier (figuur 2). Als u hebt gekozen voor een vrouwelijke vis, moet u de ontwikkeling van eieren schep van de lichaamsholte, die kan heel eenvoudig worden gedaan met behulp van een schuine paar pincetten of pincet. Gebruik dissectie naalden om pin van het lichaam muren open voor een dissectie lade en de pinnen, zodat de nieren kunnen worden gevisualiseerd hoek. De nier zal beschikken over een karakteristieke vorm (hoofd, romp / zadel, staart) en de kleur, wordt afgewisseld met zwarte hued pigmentatie (figuur 2). U kunt ook de aorta gevuld met perifeer bloed, die naar beneden loopt de middellijn van het orgel structuur. Gebruik fijn pincet om de nieren los te maken van het dorsale lichaam muur, met behulp van een paar pincetten om de nier te heffen als je los het orgel van het bindweefsel, dat het ten grondslag liggen. Plaats voorzichtig de nier in de gewenste voertuig voor de verdere live cell studies, zoals een microcentrifugebuis met 1x PBS voor FACS voorbereiding. 2. Voorbereiding en dissectie van de volwassen zebravis nier van een dier vast monster Bereid een oplossing van 4% paraformaldehyde/1X PBST. Kook de oplossing voor de PFA te ontbinden in oplossing, dan is het mengsel afkoelen tot 4 ° C en voeg 0,1% dimethylsulfoxide. We hebben het meeste succes met weefsel behoud van het gebruik van vers gemaakte PFA-oplossingen, in tegenstelling tot diepvries fracties. Maak voldoende oplossing om onder te duiken de volwassen zebravissen tijdens de dissectie. Vul een dissectie bak met voldoende fixatie oplossing om onder te duiken de volwassen zebravissen gedurende de dissectie. Wij voeren de volgende stappen met deze lade gepositioneerd onder de microscoop, die kan worden geplaatst in een chemische kap om de blootstelling aan fixatie geuren te minimaliseren. Kies een volwassen zebravissen tussen 3-6 maanden in leeftijd voor dissectie. Euthanaseren de vis door deze in een schaal met 0,2% tricaïne pH 7.0 voor ongeveer 5 minuten kijken zorgvuldig om te zien dat de kieuwen en het hart stoppen met kloppen. Met behulp van een lepel, til de vis uit de tricaïne bad in een kleine hoeveelheid van de oplossing, giet de oplossing en voorzichtig het dier op een papieren handdoek. Gebruik een scherp paar van dissectie schaar aan de kop van het dier te verwijderen, het maken van een snede net achter de kieuw operculum (Figuur 1, pad A). Gooi het hoofd in een biologisch gevaarlijk afval container, en onmiddellijk het dier te plaatsen in de PFA-bevattende dissectie lade. Gebruik de dissectie schaar om het lichaam van het dier te openen, door het maken van een lange ventrale incisie, te beginnen met het hoofd en eindigt bij de staart aan de basis van de staartvin (figuur 1, pad B), en houdt het lichaam gedeeltelijk onder het tijdens de de procedure. Verwijder de interne organen van het dier met behulp van een paar van de dissectie pincet / tang, en plaats ze in biologisch gevaarlijk afval. Wees voorzichtig dat u de dorsale lichaamswand borstel, want dit is de locatie van de nier (figuur 2). Gebruik dissectie naalden om pin openen van het lichaam muren, en de pinnen, zodat de nieren kunnen worden gevisualiseerd hoek. De nier zal beschikken over een karakteristieke vorm (hoofd, zadel, staart) en de kleur, wordt afgewisseld met zwarte hued pigmentatie (figuur 2). U kunt ook de aorta gevuld met perifeer bloed, die naar beneden loopt de middellijn van het orgel structuur. 'S nachts vast het monster, het plaatsen van de lade bij 4 ° C wanneer u klaar bent met het regelen van de gewenste monsters. De volgende dag, verwijder de PFA-oplossing uit de lade en vervang met 1x PBST. Gebruik fijn pincet om de nier voorzichtig los te maken van het dorsale lichaam muur, met behulp van een paar pincetten om de nier te heffen als je los het orgel van het bindweefsel, dat het ten grondslag liggen. Het nierweefsel wordt zacht en soepel worden van de DMSO in het fixeermiddel oplossing, waardoor het mogelijk is om de gehele nier orgel ontleden in een stuk. Gebruik een bredeboring overdracht pipet om de nier te plaatsen in een microcentrifugebuis. De nier kan nu verder worden verwerkt tot histologische of hele berg gedrag in situ genexpressie studies op basis van de gewenste studie. 3. Representatieve resultaten: De stappen die zijn schematisch in figuur 1 geven de dissectie procedure. De nier kan worden geïdentificeerd op basis van zijn karakteristieke vorm en kleur, en anatomische locatie op de dorsale wand van het lichaam van het dier holte, zoals weergegeven in figuur 2. Na ontleding van een vaste nier monster, ganse berg in situ hybridisatie kan worden gebruikt om lokaliseren van de expressie van een gen van belang, zoals weergegeven in figuur 3. Figuur 1: Procedure die directe toegang voor het ontleden van de zebravis volwassen nier mogelijk maakt. (A) gedood zebravis is ontleed in een stapsgewijze manier (aangegeven met nummers en pijlen) aan de onderzoeker geeft de gemakkelijkste toegang tot de volledige nier orgel. Beelden van de buikholte vóór (B) en na (C) het verwijderen van de buikorganen. Figuur 2:. Visualisatie van de zebravis nier in een niet vastgelegde steekproef Na verwijdering van organen in het lichaam holte, de nieren verschijnt als een enkele, afgeplatte orgaan dat is aanhanger van de dorsale lichaamswand via het bindweefsel (A), en is geschematiseerd (B) aan de anatomische vorm te tonen. Figuur 3: Hele monteren in situ hybridisaties uitgevoerd op de gehele volwassen nier orgel. (A) cadherin17 transcripten zijn gedetecteerd in de tubulus van volwassen nieren nefronen, uitgebreid in (A '). (B) mafba transcripties zijn proximale nefron celtypen in de volwassen nier (te vergelijken met hele tubulus in paneel A) gelokaliseerd. (B' ) Een vergroot aanzicht van mafba expressie blijkt dat transcripties zijn specifiek gelokaliseerd in het podocyte (P) cellen van het bloed filter (glomerulus) en de proximale tubulus (PCT).