Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

1. Saç tuzak Bir tuzak kurmak için önce, ideal bir konuma pika habitat veya talus eğimi içinde belirlenecek. Bu hayvanlar yaz sonu gibi tuvaletleri sitelerinde bulunan taze scats topladığımız bitki örtüsü önbelleklerini saman yığınları içerir. Şeritler ambalaj bant (uzunluğu 10-50cm), 360 derecelik bir yapışkan bir yüzey sağlamak için alınır ve zarf pika saman yığını (Şekil 1) veya tuvalet sitenin girişinde bir web gibi bir şekilde düzenlenmiştir. Misina kayaların yapılandırmasına bağlı olarak, bir parça saç tuzak yapısını desteklemek için kullanılır, fakat bu girişleri, tam olarak bir açıklama kullanımı oldukça küçük (çapı <30cm) çoğu zaman gerekli değildir. Henry ve Russello (2010) 3 misina bulunabilir. Saç tuzaklarına mümkün olduğunca sık kontrol ve bant (Şekil 2) saç örnekleri üzerinde biriken sonra toplanan ve etiketlenir. Laboratuara bir kez geri taşınır, saçlar daha fazla manipülasyon kadar steril forseps kullanarak yapışkan bandı kaldırılmış ve kriyojenik tüpler aktarılır ve -20 ° C'de saklanır. Bağımsız kümelenmiş örnekleri farklı bireylere ait olduğu kabul edilir bir saç tuzak boyunca bir araya kümelenmiş Saç örnekleri, tek bir bireye ait olduğu kabul edilir. İkinci durumda, saç farklı tüpler yerleştirilir. Bu varsayımlar, daha sonra mikrosatellit genotipik verilere göre DNA parmak izi ve kimlik olasılık hesabı yoluyla test edilebilir. 2. DNA ekstraksiyonu Pika saç çok ince ve çok küçük bir kök ampul içerdiğinden, daha önce en az 25 kılların kaliteli downstream PCR 3 için yeterli miktarda DNA elde etmek için gerekli olduğunu göstermiştir . Biz DNA IQ sistemi (Promega, Madison, WI, USA) ve kıl örneklerinden DNA izolasyonu için üreticinin talimatlarına biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanıldı. Öncelikle, saç örneği tüp açarken saç kaybını önlemek amacıyla bir mikro santrifüj eğirilir. Daha sonra kuluçka çözüm Proteinaz K. Kuluçka 0.1 M DTT ve 1.8ng/ml bir final konsantrasyon neden DTT 10μl (1M) ve 10μl, proteinaz K (18ng/ml) ile 80 ul inkübasyon çözüm karıştırılarak hazırlanır solüsyonu (100 ul) örnek eklenir ve 56 ° C 'de 1 saat süreyle inkübe edilir. Bu arada, lizis çözüm 0.01m son bir DTT konsantrasyon, lizis tamponu her 100 ul DTT (1M) 1 ul ekleyerek hazırlanır. Hazırlanan lizis solüsyonu (200 ul), daha sonra 7 ul DNA IQ reçine ile birlikte, örnek, yüksek hızda 3 saniye için vortekslenmiş ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe. Örnek sonra 2 saniye boyunca vortekslenmiş ve manyetik boncuk çözüm ayrılması meydana gelen manyetik standı, takılmış. Sonra kalan çözüm emişli ve atılır, manyetik reçine pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak. Örnek sonra hazırlanan lizis çözüm vortekslenmiş ve ayrılık yeniden oluşursa manyetik stand döndü 100 ul ile tedavi edilir. Aspire lizis tamponu ve atılır ve bu adımı yıkama tamponu (100 ul) kullanarak üç kez tekrarlanır. Örnek daha sonra, 15 dakika boyunca manyetik stand kurumaya bırakılır. Kuruduktan sonra, 100 ul elüsyon tampon örnek eklenir ve 65 ° C'de 5 dakika inkübe. Örnek vortekslenmiş ve manyetik stand içine eklenir. Yıkandı, DNA içeren bir çözüm daha sonra 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarılır ve daha fazla manipülasyonlar kadar -20 ° C'de saklanır. Karaciğer örneklerinden DNA DNA IQ sistemi kullanılarak ayıklanır ve PCR için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. 3. PCR Noninvaziv saç tuzak ve karaciğer örnekleri elde edilen DNA, sonra yaygın olarak kullanılan moleküler belirteçlerin (mikrosatellit, AFLP, mitokondriyal sitokrom B ve ZFX / ZFY cinsiyet tayini işaretleyici) bir paketi yükseltmek için kullanılır. – 20 ng DNA, her astar 0.5 mcM, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM 10: PCR içeren 25 mcL hacmi Veriti termal cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) kullanılarak yapıldı KCl, 1.5 mM MgCl 2, 200 mcM dNTP, 10 μ sığır serum albumini (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, ABD) ve 0.5 U AmpliTaq Gold DNA polimeraz (Applied Biosystems). Mikrosatellit lokus'u Bisiklete binme parametreleri (95 10 dakika bir gol bisiklet programı kullanılarak optimize edilmiştir ° C, 95 ° C – 30 s, 30 s tavlama az 35 kür, 45 sn ve 72 ° C, 72 son bir adım ° C 10 dk). 1 azalarak tavlama ° C sıcaklık döngüsü başına 60 ila 55 ° C kalan 29 döngüleri 55 devam altıncı döngüsü, hangi noktada ° C ulaşana kadar Mitokondriyal parçaları için Bisiklete binme parametreleri yukarıda açıklandığı gibi ama bir tavlama ile 35 döngü oluşturdu50 ° C sıcaklık Amplifiye Fragment Uzunluk Polimorfizm Bonin 4 tarafından açıklanan omurgalı genomların için protokol yapıldı. Son olarak, moleküler cinsiyet tayini HinfI restriksiyon enzim sindirimi 5 ZFX / ZFY lokusların PCR-RFLP yöntemi kullanılarak yapıldı. Sindirilir ZFX / ZFX parçaları içeren% 3 agaroz jel üzerinde 100 baz puan (bp) merdiven (New England Biolabs) yanında çalıştırmak iken mikrosatellit AFLPs ve sitokrom B dizileri PCR ürünleri, ABI 3130XL genetik analizör (Uygulamalı Biyosistem) üzerine çalıştırmak % 2.5 SYBR Güvenli DNA jel leke (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ve KIRMIZI kişisel bir jel görüntüleme sistemi (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA) kullanılarak görüntülenebilmekte. Mikrosatellit ve AFLPs Genemapper v3.7 (Uygulamalı Biyosistem) ve mitokondriyal DNA kromatogram kullanarak Sequencher v4.7 (Gen Kodu Corporation, Ann Liman, MI, USA) kullanılarak görüntülendi görüntülendi. 4. Temsilcisi sonuçları Bizim noninvaziv tuzak kullanılarak elde edilen saç örneklerinden çıkarılan DNA PCR moleküler belirteçler çeşitli tip yükseltmek için kullanılmıştır. DNA karşılaştırması için bir temel olarak karaciğer örnekleri saç örnekleri yanında amplifiye edildi kullanarak ayıklanır. Nükleer mikrosatellit lokus'u saç ve karaciğer örnekleri (Şekil 3) hem de başarılı bir şekilde amplifiye edildi. Karaciğer örnekler kullanılarak sinyal yoğunluğu daha fazla olmasına rağmen, bu genotip puanlama üzerinde olumsuz bir etkisi yoktu (Şekil 3). AFLPs (Şekil 4), mitokondriyal DNA dizilerinin (Şekil 5) ve ZFX / ZFY moleküler cinsiyet tayini işaretleyici (Şekil 6) kullanarak benzer sonuçlar elde edildi. Şekil 1 noninvaziv bir saç tuzak bir örnek, bir saman yığını. Kadar rulo ambalaj bant şeritler, saman yığını girişinde içine bir web gibi moda düzenlenmiştir. Misina bir parça saç tuzak için ek destek sağlamak için kullanılır. Şekil 2'de ambalaj bandı sıkışmış saç çok sayıda içeren bir başarıyla saç snare Şekil 3 bir temsilci nükleer mikrosatellit kromatogram (Ocp6) 8 Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) görüntülenir. Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA ile elde edilen ve bu lokus (354/358) heterozigot idi. Alt kromatogram saç çıkarılan DNA dayalı bir heterozigot genotip (358/362) sergileyerek farklı bir kişi temsil eder. Saç örneği kromatogram sinyal karaciğer örneği daha düşük bir yoğunluğu olsa da, genotip puanlama sinyal bu fark olumsuz etkilenmez. Şekil 4 temsilcisi AFLP kromatogram (E31T32) Genemapper v3.7 (Uygulamalı Biosystems) görüntülenir. Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA elde edildi, alt kromatogram saç çıkarılan DNA temsil eder. Şekil 5 Sequencher v4.7 (Gen Kod Corporation) görüntülenen bir temsilci, mitokondriyal DNA dizisi kromatogram (sitokrom B). Üst kromatogram karaciğer dokusu yükseltme DNA elde edildi, alt kromatogram saç çıkarılan DNA temsil eder. Şekil 6, karaciğer ve saç örnekleri için yükseltilen temsili moleküler cinsiyet tayini işaretleyici (ZFX / ZFY) . Bu yaklaşım, Y kromozomu X kromozomu yoksun olduğunu, bu bölgede bir HinfI kısıtlama sitenin sahip olduğu gözlemine dayanır. Erkeklerde ise 432 bp, 261 bp ve 171 bp parçaları üreten Böylece, kadınlarda 432 bp iki ortak göç parçaları üretir.