Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

1. Capelli rullante Prima della creazione di una trappola, una posizione ideale deve essere determinato entro l'habitat pika o scarpata. Questo include mucchi di fieno, che sono cache vegetazione che gli animali raccolgono a fine estate così come escrementi freschi trovati in siti latrina. Strisce di nastro di imballaggio (10-50cm di lunghezza) sono arrotolate per fornire a 360 ° appiccicoso superficie e sono disposti in una web-come il modo di busta l'ingresso al mucchio di fieno del pika (Fig. 1) o sito latrina. A seconda della configurazione delle rocce, un pezzo di filo da pesca può essere utilizzato per sostenere la struttura dal laccio dei capelli, ma questo spesso non è necessario quando le entrate sono molto piccole (30cm <di diametro), una descrizione completa dell'uso di linea di pesca si trovano in Henry e Russello (2010) 3. Insidie ​​capelli vengono controllati più spesso possibile, e campioni di capelli depositato sul nastro (Fig. 2) vengono poi raccolti ed etichettati. Una volta trasportato al laboratorio, i peli vengono rimossi dal nastro adesivo con pinza sterile e trasferiti in tubi criogenici e conservati a -20 ° C fino a ulteriori manipolazioni. Campioni di capelli raggruppati insieme lungo un laccio dei capelli sono considerate appartenenti ad un singolo individuo, mentre i campioni raggruppati in modo indipendente si presume che appartengono a persone diverse. In quest'ultimo caso, il pelo è poi messo in tubi diversi. Queste ipotesi possono poi essere sperimentato nell'ambito di impronte digitali del DNA e calcoli delle probabilità di identità basata su microsatellite dati genotipici. 2. Estrazione del DNA Poiché i capelli pika è molto sottile e contiene una piccola lampadina di radice, abbiamo precedentemente dimostrato che un minimo di 25 peli sono necessari per ottenere quantità sufficienti di DNA per una buona qualità di amplificazione a valle della PCR 3. Abbiamo usato il DNA del sistema IQ (Promega, Madison, WI, USA) e una versione leggermente modificata di istruzioni del produttore per l'isolamento di DNA da campioni di capelli. In primo luogo, il campione di capelli è filato giù in una micro-centrifuga al fine di evitare la perdita dei capelli durante l'apertura del tubo. Allora la soluzione di incubazione è preparata mescolando 80 ml di soluzione di incubazione con 10μl di DTT (1M) e 10μl di proteinasi K (18ng/ml) per portare a una concentrazione finale di 0,1 M DTT e 1.8ng/ml di incubazione proteinasi K. soluzione (100 l) viene aggiunto al campione e incubare a 56 ° C per 1 ora. Nel frattempo, la soluzione di lisi è preparata con l'aggiunta di 1 ml di DTT (1M) per ogni 100 microlitri di tampone di lisi, con una conseguente concentrazione DTT finale di 0.01M. Soluzione di lisi preparata (200 microlitri) viene poi aggiunto il campione, insieme con 7 ml di resina DNA IQ, in agitazione per 3 secondi ad alta velocità e incubate a temperatura ambiente per 5 minuti. Il campione viene quindi in agitazione per 2 secondi e inserito nel supporto magnetico, in cui la separazione delle sfere magnetiche dalla soluzione si verifica. La soluzione rimanente viene poi aspirato ed eliminato, facendo attenzione a non disturbare il pellet di resina magnetica. Il campione viene quindi trattato con 100 microlitri della soluzione di lisi preparata, agitazione orizzontale e restituito al supporto magnetico in cui la separazione si verifica nuovamente. Il buffer di lisi è aspirato ed eliminato, e questo passo è ripetuto tre volte con un tampone di lavaggio (100 l). Il campione viene poi lasciato ad asciugare nello stand magnetico per 15 minuti. Una volta asciutto, 100 ml di tampone di eluizione è aggiunto al campione e incubare a 65 ° C per 5 minuti. Il campione è in agitazione e inserito nel supporto magnetico. La soluzione che ora contiene il DNA eluito è poi trasferito in una provetta Eppendorf da 1,5 ml e conservati a -20 ° C fino a ulteriori manipolazioni. DNA da campioni di fegato è stato anche estratto con il sistema IQ DNA e utilizzato come controllo positivo per amplificazioni PCR. 3. Amplificazione PCR Il DNA ottenuto dal nostro rullante capelli non invasivo e campioni di fegato sono stati poi utilizzati per amplificare una suite di uso comune marcatori molecolari (microsatelliti, AFLP, mitocondriale citocromo B e ZFX / ZFY marcatore sexing). PCR sono state eseguite utilizzando un Veriti termociclatore (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in un volume di 25 microlitri contenente: 10 – 20 ng di DNA, 0,5 mM di ciascun primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 mM dNTPs, 10 μ albumina sierica bovina (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) e 0,5 U AmpliTaq DNA polimerasi Gold (Applied Biosystems). Parametri di ciclismo per i loci microsatelliti sono stati ottimizzati utilizzando un programma di ciclismo touchdown (10 min a 95 ° C, 35 cicli a 95 ° C per 30 s, 30 s ricottura, e 45 s a 72 ° C, seguita da una fase finale a 72 ° C per 10 min). La temperatura di annealing è diminuita di 1 ° C ogni ciclo di 60-55 ° C fino a raggiungere il sesto ciclo, a questo punto le 29 rimanenti cicli continuato a 55 ° C. Parametri di ciclismo per i frammenti mitocondriale sono state come sopra descritto, ma consisteva di 35 cicli con una ricotturatemperatura di 50 ° C. Amplificato polimorfismo della lunghezza dei frammenti è stata intrapresa a seguito del protocollo di genomi dei vertebrati descritto da Bonin 4. Infine, sessaggio molecolare è stata effettuata utilizzando la PCR-RFLP di ZFX / ZFY loci digestione con enzimi di restrizione HinfI 5. I prodotti PCR dal, AFLPs microsatelliti e sequenze del citocromo B sono stati eseguiti su un analizzatore genetico ABI 3130XL (Applied Biosystems), mentre digerito ZFX / ZFX frammenti sono stati eseguiti lungo una scala 100 bp (New England Biolabs) su un 3% gel contenente 2,5% gel DNA SYBR Safe. macchia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e visualizzati utilizzando un sistema di imaging ROSSO personale gel (Alpha Innotech, San Leandro, California, USA) Microsatelliti e AFLPs sono state visualizzate mediante Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) e il cromatogramma DNA mitocondriale è stata osservata con Sequencher v4.7 (Gene Codice Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Rappresentante risultati Il DNA estratto da campioni di capelli ottenuto con il nostro rullante non invasiva sono stati utilizzati per amplificare PCR vari tipi di marcatori molecolari. Come base per il confronto, usando campioni di DNA estratto di fegato è stato amplificato insieme ai nostri campioni di capelli. Nucleare loci microsatelliti sono stati amplificati con successo sia per i capelli e campioni di fegato (Fig. 3). Anche se l'intensità del segnale era maggiore quando si utilizzano i campioni di fegato, questo non ha avuto un effetto negativo sul punteggio genotipo (Fig. 3). Risultati simili sono stati ottenuti utilizzando AFLPs (Fig. 4), sequenze di DNA mitocondriale (Fig. 5), e il ZFX / ZFY marcatore sessaggio molecolare (Fig. 6). Figura 1. Un esempio di trappola capelli non invasivo istituito presso un mucchio di fieno. Strisce di nastro adesivo trasparente arrotolato imballaggio sono disposti in un web-come la moda di allegare l'ingresso del mucchio di fieno. Un pezzo di filo da pesca è qui usato per fornire sostegno supplementare per il rullante capelli. Figura 2. Una trappola capelli successo contenente un gran numero di capelli attaccati al nastro di imballaggio. Figura 3. Un cromatogramma rappresentativo microsatelliti nucleari (Ocp6) 8 che vedi nell'immagine Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, ed è eterozigote (354/358) a questo locus. Il cromatogramma basso rappresenta un individuo diverso che presentano un genotipo eterozigote (358/362) a base di DNA estratto da peli. Mentre il segnale del cromatogramma dal campione dei capelli ha una minore intensità rispetto al campione di fegato, segnando genotipo non è pregiudicata da questa differenza di segnale. Figura 4. AFLP un cromatogramma rappresentativo (E31T32) come mostrato in Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, il cromatogramma basso rappresenta il DNA estratto dai capelli. Figura 5. Un rappresentante cromatogramma sequenza del DNA mitocondriale (citocromo B) come mostrato in Sequencher v4.7 (Gene Codice Corporation). Il cromatogramma in alto è stato ottenuto amplificando il DNA da tessuto epatico, il cromatogramma basso rappresenta il DNA estratto dai capelli. Figura 6. Un indicatore rappresentativo sessaggio molecolare (ZFX / ZFY), amplificata sia per fegato e campioni di capelli. Questo approccio si basa sull'osservazione che il cromosoma Y possiede un sito di restrizione HinfI in questa regione del cromosoma X che manca. Quindi, le femmine producono due co-migrazione dei frammenti di 432 bp, mentre i maschi producono frammenti di 432 bp, 261 bp e 171 bp.