뉴트의 렌즈 재생을 공부 Culturing 이리스 안료 상피 세포에 대한 시스템

1. 이리스 세포 배양 7 newts (PBS의 준비 3 aminobenzoate 메탄 sulfonic의 산성 에틸 0.1 %에 anesthetized)과 칼슘, 마그네슘 무료 행크스 솔루션 (CMF)에서 곳에서 눈알를 수집합니다. 장갑을 변경하고 조직 문화 후드에서 작동합니다. 3 초 Lugol's – EtOH의 눈 볼을 소독. CMF 2 번 씻으십시오. 행크스에 눈을 전송과 절개를 시작합니다. 홍채 – 각막 복잡한을 해부하다 및 신경 망막를 제거합니다. 행크스의 새로운 그릇에 단지를 전송합니다. 지느러미 및 복부 반쪽에 # 15 메스, 별도의 단지를 사용하여. 1 ML은 L – 15을 포함하는 접시에 홍채 조각 (최초 복부)와 장소를 제거합니다. 15 % (150 UL) dispase의 볼륨 (7.5 단위 / ML 농도)을 추가합니다. 27 2 시간 동안 ° C (parafilm와 랩 요리)에 품어. 스트 로마 (27시 플레이스 트립신 용액 ° C)에서 IPE 세포를 분리. 1.5 ML 튜브에 IPE 세포를 수집합니다. 이분에 대한 RT에서 1,000 RPM (실온)에서 원심 분리기, 뜨는 제거합니다. 2 분 동안 RT에서 1000 RPM 1 ML 행크스와 원심 분리기와 세척 뜨는 제거합니다. 27에서 2 시간 동안 품어 ° C., 1 ML 트립신 솔루션 추가 이분에 대한 RT에서 1,000 rpm으로 원심 분리기는 트립신을 제거하십시오. 2 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기, 씻어 1 ML L – 15을 추가합니다. 천천히 위아래로 800 UL L – 15, pipet ~ 10 번 (이상 12 회가 부착을 줄일 수) 추가합니다. 플레이트 27 24 잘 콜라겐 코팅 판과 부화에 IPE 세포 ° C 이주 (보통, 4 등의 4 복부 우물이 7 newts에서 얻을 수있다)에 대한. 이 단계에서 세포는 유전자 transfection 또는 유도하거나 렌즈 재생을 방해하는 그들의 역할을 결정하는 요인과 치료에 적합합니다. 2. 이리스 세포의 집합 번호판을 포함 홍채 세포는 부드럽게 400 μl 매체 소용돌이에 dispase 솔루션의 20μl를 추가합니다. 27 ° C 야간에 대한 번호판을 품어. Pipet 부드럽게 위아래로 세포를 이동시키다하기 Eppendorf 튜브 및 RT에서 1,000 rpm으로 2 분 스핀에 플레이스 세포. 1 ML 전체 L – 15을 추가하여 중간 및 세척을 제거, RT에서 1,000 rpm으로 2 분 스핀 매체를 제거합니다. 집합마다 2000-7000 세포를 사용합니다. 각각의 튜브로 집계 200 UL L – 15을 추가합니다. 새로운 eppendorf 튜브에 분할 세포 (200 μl). RT 2 분 1,000 rpm으로 회전. 27 48 시간을위한 품어 ° C. 3. Aggregrated 세포의 주입 뉴트의 눈 각막에 슬릿을하고 렌즈를 제거합니다. 렌즈 제거 후 눈 복부 측면에 바로 각막 조직 아래 IPE 세포 집계를 놓습니다. newts은 그들이 렌즈를 다시 생성하도록 한 달 동안 보관됩니다. 4. 뉴트 아이의 포함 집계로 이식 뉴트의 눈을 제거하고 인산에 배치 호수 (PBS)가 버퍼. 최소 4 시간 또는 밤새 4 ° C에서 4 % paraformaldehyde에 수정. 30 분 PBS, 4 ° C에서 씻으십시오. 4 ° C, 30 분 0.85 %의 식염수에 그것을 취급합니다. 15 분 동안 RT : 살린 / 에탄올 (1:1)에 씻으십시오. 70 % 에탄올에 세척 : RT, 15 분. 한번 반복합니다. RT 30 분 각 85 % 에탄올과 95 % 에탄올로 세척 100 % 에탄올에 세척 : RT, 30 분. 한번 반복합니다. 4 스토어 ° C 또는 계속합니다. 100 % 크실렌의 세척 : RT, 30 분. 한번 반복합니다. 60 ° C, 45 분 : 크실렌 / 파라핀 (1:1)으로 처리합니다. 60 ° C, 20 분 100 % 파라핀과 치료. 그것을 두 번 더 반복합니다. 금형을 포함에 삽입할 수 있습니다. 5. Sectioning 마이크로톰를 사용하여 임베디드 눈 15 μm의 섹션을 준비합니다. 젤라틴 코팅 슬라이드에 눈 섹션을 장소와 따뜻한 슬라이드에두고. 6. 더럽히는 것 이곳은 10 분 크실렌에 슬라이드. 한번 더 반복합니다. 의 하이드 레이트 : 100 %, 95 %, 80 %, 70 %, 일분 각 30 % 에탄올 잠시 디 물에 헹굼. 15 분 동안 PBS로 씻으십시오. 15 분 동안 PBST (PBS에 0.​​2 % 트리톤 X – 100)에 씻으십시오. 15 분 동안 PBS로 씻으십시오. 한시간 솔루션 (10 % 염소 차 항체)를 차단에 놓습니다. 하룻밤에 대한 기본 항체에 놓습니다. 15 분 동안 PBS의 기본 항체를 씻으십시오. 15 분 PBST로 씻으십시오. 15 분 동안 PBS로 씻으십시오. 어둠 속에서 2 시간 동안 차 항체에 플레이스 (PBS에 희석 1:100). 십오분 각 후 마운트를위한 PBS, PBST, 그리고 PBS로 씻으십시오. 형광 현미경 슬라이드를 관찰합니다. 7. 대표 결과 : culturing 뉴트 IR의이 절차는는 세포는 지느러미와 복부 IPE 세포의 재생 가능성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 또한, 그것은 뉴트 안구의 렌즈 재생 메커니즘으로 기여하는 특정 유전자를 연구하는 것도 가능합니다. 전지은 2 주 동안 교양되었을 경우 (그림 1) 이들은 렌즈에서 재생 기능을 조사하는 유전자로 transfected 수 있습니다. 특히 관심의 복부 아이리스 유발 유전자 수 있습니다. 복부 홍채 세포가 렌즈에 transdifferentiate 수 없기 때문에 (그림 2) 후보 유전자의 유도 기능을 공부하실 수 있습니다. 과거에는이 기법을 사용하는 우리는 여섯 3이 넘는 retinoic 산성 렌즈 유도의 존재로 표현되었을 때 복부 홍채 6 관찰되었다 것으로 나타났습니다. 그림 3에서는 복부 이리스 집계는 지느러미 홍채 (화살표)에서 호스트 렌즈와는 다른이 아닌 완전히 성장과 차별화된 렌즈 (화살촉)에 상승을 준 것을 알 수 있습니다. 그림 1. A) 도설 홍채 색소 상피 세포는 2 주 동안 체외에서 배양해. B) 복부 홍채 색소 상피 세포는 2 주 동안 체외에서 배양해. 착색은 지느러미와 복부 양쪽 홍채 세포에서이 단계로 계속합니다. 그림 2. 교양 IPE 세포의 재생 능력. 지느러미 IPE 세포 집계 (화살촉)에서) 렌즈 유도. 지느러미 홍채 (화살표), DI에서 렌즈 유도 호스트 : 지느러미 홍채, 바이 : 복부 홍채, 르 : 렌즈 상피,면 : 렌즈 섬유. 복부 IPE 세포 집계 (화살촉)에서 렌즈 유도의 B) 부재. 지느러미 홍채 (화살표)에서 렌즈를 유도 호스트. 그림 3. 복부 집계에서 렌즈 유도 여섯 – 3 transfected 및 retinoic 산성과 치료. 지느러미 홍채 (화살표)에서 렌즈를 유도 호스트. 복부 집계 (화살촉)에서 렌즈 유도.