Un système de culture de cellules épithéliales de l'iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

1. Culture cellulaire Iris Recueillir globes oculaires de 7 tritons (anesthésiés dans 0,1% éthyl 3-aminobenzoate d'acide méthane sulfonique préparée dans du PBS) et le lieu en calcium magnésium libre solution de Hanks (CMF). Changer de gants et de travailler dans la hotte de culture de tissus. Stériliser globes oculaires dans le Lugol-EtOH pendant 3 secondes. Laver 2 fois au FCM. Transfert aux yeux Hanks et commencer la dissection. Disséquer l'iris-cornéen complexes et enlever rétine neurale. Transfert complexes dans un nouveau plat de Hanks. Utiliser # 15 scalpel, complexes séparés en deux moitiés dorsale et ventrale. Enlever les fragments de l'iris (ventrale en premier) et placer dans un plat contenant 1 ml de L-15. Ajouter 15% (150 ul) volume de dispase (7,5 unités / ml de concentration). Incuber à 27 ° C pendant 2 heures (plat envelopper avec du parafilm). Isoler les cellules du stroma IPE (solution de trypsine Placez à 27 ° C). Recueillir les cellules IPE dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger à 1000 rpm à température ambiante (température ambiante) pendant 2 minutes, retirer le surnageant. Laver avec 1 ml Hanks et centrifuger à 1000 rpm à température ambiante pendant 2 minutes, retirer le surnageant. Ajouter 1 ml solution de trypsine; incuber pendant 2 heures à 27 ° C. Centrifuger à 1000 rpm à température ambiante pendant 2 minutes, retirez la trypsine. Ajouter 1 ml de L-15 de se laver, centrifugeuse à 1000 rpm pendant 2 minutes. Ajouter 800 ul L-15, pipette lentement de haut en bas ~ 10 fois (plus de 12 fois réduit l'adhérence). Assiette des cellules IPE sur une plaque 24 de collagène bien enrobées et incuber à 27 ° C pendant 2 semaines (habituellement, quatre dorsales et ventrales 4 puits sont obtenus à partir de 7 tritons). A ce stade, les cellules sont adaptées pour la transfection de gènes ou d'un traitement avec des facteurs afin de déterminer leur rôle dans l'induction de la régénération ou à interférer avec l'objectif. 2. Agrégation des cellules Iris Pour les plaques contenant des cellules de l'iris ajouter 20 pi de solution dispase à 400 pl de milieu, remuer doucement. Incuber les plaques à 27 ° C pour la nuit. Pipet doucement de haut en bas pour déloger les cellules Placer dans les cellules du tube Eppendorf et de spin 2 minutes à 1000 rpm à température ambiante. Retirer et laver moyennes en ajoutant 1 ml de L-15 complète, spin 2 minutes à 1000 rpm à RT, éliminer le milieu. Utilisez 2000-7000 cellules par agrégat. Ajouter 200 ul L-15 par agrégat dans chaque tube. Fractionner les cellules (200 pi) dans des tubes Eppendorf de nouvelles. Centrifuger à 1000 rpm pendant 2 min à température ambiante. Incuber pendant 48 heures à 27 ° C. 3. L'implantation de cellules Aggregrated Faire une fente dans la cornée de l'œil de triton et retirez l'objectif. Après retrait du cristallin, placer l'agrégat de cellules IPE juste en dessous du tissu cornéen sur la face ventrale de l'œil. Les tritons sont conservés pendant un mois pour leur faire régénérer la lentille. 4. Intégration des yeux Newt Retirez les yeux Newt implanté à l'agrégat et le placer dans un tampon phosphate salin (PBS). Fixer dans du paraformaldéhyde 4% à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou jusqu'au lendemain. Laver dans du PBS, 4 ° C pendant 30 minutes. Traitez-le avec une solution saline 0,85%: 4 ° C, à 30 minutes. Laver à Saline / éthanol (1:1): RT pendant 15 minutes. Laver à l'éthanol 70%: RT, à 15 minutes. Répétez une fois. Laver à l'éthanol 85% et 95% d'éthanol à température ambiante, 30 minutes chacune Laver à l'éthanol à 100%: RT, à 30 minutes. Répétez une fois. Conserver à 4 ° C ou de continuer. Laver à 100% du xylène: RT, à 30 minutes. Répétez une fois. Traitez-les avec du xylène / paraffine (1:1): 60 ° C, à 45 minutes. Traiter avec de la paraffine à 100%: 60 ° C, à 20 minutes. Répétez ce deux fois plus. Intégrer dans l'intégration des moules. 5. Sectionnement Préparer 15 sections um de l'œil embarqué utilisant un microtome. Placez les sections oeil sur une lame de gélatine couché et le laisser sur le réchauffement de diapositives. 6. Coloration Placer les lames dans le xylène pendant 10 minutes. Répétez encore une fois. Hydratez dans: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% d'éthanol pendant 1 minute de chaque Rincer à l'eau DI pendant une minute. Laver dans du PBS pendant 15 minutes. Laver dans du PBST (0,2% de Triton-X 100 dans du PBS) pendant 15 minutes. Laver dans du PBS pendant 15 minutes. Placer dans la solution de blocage (anticorps de chèvre 10% du secondaire) pendant une heure. Placer dans l'anticorps primaire pour la nuit. Lavez anticorps primaire dans du PBS pendant 15 minutes. Laver dans du PBST pendant 15 minutes. Laver dans du PBS pendant 15 minutes. Placer dans anticorps secondaire pendant 2 heures dans l'obscurité (1:100 dilution en PBS). Laver dans du PBS, PBST et PBS pendant 15 minutes chacun, puis monter. Observez la glisse sous un microscope à fluorescence. 7. Les résultats représentatifs: Cette procédure de mise en culture Newt irn'est cellules a été utilisée pour étudier le potentiel de régénération de la dorsale et les cellules ventrales IPE. Par ailleurs, il est également possible d'étudier les gènes spécifiques qui contribuent à l'objectif de mécanisme de régénération dans l'oeil de triton. Lorsque les cellules ont été cultivées pendant 2 semaines (figure 1) ils peuvent être transfectées par des gènes d'examiner leur fonction dans la régénération de l'objectif. D'intérêt particulier sont les gènes qui pourraient induire l'iris ventral. Puisque les cellules ventrales iris ne peut pas transdifférencier à la lentille (figure 2) la fonction d'induction d'un gène candidat peut être étudiée. Dans le passé, en utilisant cette technique, nous avons montré que lorsque six-3 a été surexprimé dans la présence de l'induction de l'acide rétinoïque lentilles a été observée à partir de la ventrale de l'iris 6. Dans la figure 3, nous pouvons voir que l'ensemble de l'iris ventrale a donné lieu à une lentille entièrement développé et différenciées (tête de flèche), et non pas différente de celle de la lentille d'hôte de la dorsale de l'iris (la flèche). Figure 1. a) dorsale de l'iris des cellules épithéliales pigmentées cultivés in vitro pendant une période de 2 semaines. b) ventrale de l'iris des cellules épithéliales pigmentées cultivés in vitro pendant une période de 2 semaines. Notez que la pigmentation persiste à ce stade dans les cellules de l'iris à la fois dorsale et ventrale. Figure 2. La capacité de régénération des cellules cultivées de l'IPE. induction du cristallin a) à partir agrégat de cellules dorsales IPE (flèche). Induction du cristallin hôte de l'iris dorsale (flèche), di: dorsale de l'iris, vi: ventrale de l'iris, le: épithélium lentille LF: fibres optique. b) absence d'induction du cristallin agrégat de cellules ventrales IPE (flèche). Induction du cristallin hôte de l'iris dorsale (flèche). Figure 3. L'induction de l'objectif dans agrégées ventrale transfectées avec six-3 et traitée à l'acide rétinoïque. Induction du cristallin hôte de l'iris dorsale (flèche). L'induction de l'objectif dans agrégées ventrale (flèche).