Électrophysiologie de Scorpion Peg Sensilles

1. Pré-enregistrement, la préparation des animaux vivants Retirez le scorpion de son pot d'origine et le placer dans un récipient en verre pré-réfrigérés; Ensuite, placez le pot contenant le scorpion dans un environnement de congélation (-5 ° C) pendant un minimum de deux minutes. Ce temps peut varier en fonction de l'âge, la taille, espèces, etc spécifiques de l'scorpion sous étude. Mais généralement, la phase de l'environnement de congélation est terminée une fois que l'animal est immobile. Après deux minutes, retirez le immobilisé scorpions du récipient en verre à froid, et placez-le face ventrale sur une lame de microscope. Fixez le dard, la queue, les pattes et pédipalpes avec de l'argile malléable (à base d'huile, Van Aken Plastalina). Faire une plate-forme sur laquelle mettre pectines du scorpion. Ajuster la longueur de la plate-forme et la largeur en fonction de la taille du pecten. Typiquement, nos plates-formes sont construites à partir de couvercle en verre de microscope et sont environ 10 (L) x 18 (W) mm. Adhérer ruban adhésif double-face à la plateforme pecten, parage de la bande (si nécessaire) pour s'adapter. Pour faire une chambre pectinal, mettez trois des quatre côtés de la plateforme en pré-fondu de cire (nous utilisons des puces de cire d'abeille 100%) à une profondeur de 3-4 mm. Nous fondre la cire en plaçant les jetons dans un plat en verre de Pétri, situé sur une plaque chauffante. Une fois la cire sur les bords de la chambre de pectinal est refroidi à température ambiante, ce qui devrait créer des murs de la cire d'environ 1 mm de haut. Sur l'animal, repérer le point d'insertion pectinal, et placez le bord non ciré de la plateforme (bandes latérales-up) juste derrière elle. Par la suite, de stabiliser la plate-forme (afin qu'elle ne bouge pas plus tard) en appuyant doucement sur sa droite et à gauche contre les bords périphériques de l'argile utilisée pour empêcher les jambes de l'animal. Utilisez une pince à pointe fine pour placer soigneusement le pecten ou pectines intérieur de la chambre. Plus précisément, en utilisant une pince, tenez le pecten long de la colonne pectinal, et ramenez doucement le pecten de dessous le couvercle en verre et abaissez-le sur le plancher de la nacelle adhésif. Établir un lien pecten-à-bande en appliquant soigneusement la pression de la colonne vertébrale pectinal. Maintenant, appliquez la cire fondue (nous utilisons une spatule métallique préalablement chauffé) au bord de l'ONU-ciré de la plateforme. Le but est double, pour sécuriser le pecten et à entourer complètement la chambre pour l'introduction d'huile minérale à venir. Faites preuve de prudence lors de l'application de la cire sur pecten de l'animal, car il est possible d'endommager le pecten avec de la cire trop chaude. La construction de chambre pecten est terminée. Ensuite, établir une connexion avec électrode indifférente hémolymphe de l'animal par l'insertion d'un fil d'argent entre deux segments de la queue. 2. Simultanée d'enregistrement extracellulaire et chimiques de stimulation Nous préparons l'animal 24 h avant de mener extracellulaire, pointe-enregistrements, qui, entre autres raisons (l'ajustement des animaux à savoir la position fixe), permet le temps de fabriquer sur les pipettes d'un stimulant spécifique (sensillum-dépendant) pointe diamètre. Nous utilisons un extracteur micropipette pour réaliser de telles spécifications. Idéalement, le diamètre de la pipette est ≈ 2 um plus grand que le diamètre des pores sensillar. Nous ajustons nos spécifications micropipette conséquence pour chaque animal. 1 h avant l'enregistrement, nous ajoutons 5 ul d'huile minérale dans la chambre de pectinal, submergeant le pecten dans l'huile. Ensuite, nous avons la position de l'animal sous un microscope très puissant, qui a longtemps travaille objectifs de distance et épi-illumination. Pour stimuler chimiquement peg sensilles, nous introduisons sapides aqueuse (c'est à dire l'acide citrique et de sel) par le moyen du pétrole. Tout d'abord, nous utilisons une charge micropipette pour injecter le stimulant dans la pipette stimulant. Remarque: toutes les solutions doivent contenir des stimulants de l'électrolyte pour la conductance électrique. Ensuite, après le positionnement de la pipette stimulant sur un micromanipulateur (dans le banc d'enregistrement), insérez l'électrode d'enregistrement dans le émoussé, extrémité ouverte de la pipette stimulant. Il est important pour assurer le contact entre l'électrode métallique et une solution électrolytique stimulants. Une fois la préparation est électriquement à la terre (via l'électrode indifférente), tout simplement inférieure de la pipette à travers le milieu du pétrole et sur un pore sensillar. La durée de la stimulation chimique par sensillum pectinal peut varier d'autant que trente minutes pour aussi peu que d'une seconde. Généralement, nous pouvons l'échantillon chevilles multiples (> 30) par pipette. Dans le cas où la pipette stimulants devient obstrué par des débris minute, il suffit d'échanger la pipette bouchée d'une nouvelle pipette inutilisés. 3. Préparation d'un animal pendant plusieurs jours d'expérimentation Si l'animal est à utiliser sur une période prolongée, nous recommandons de réutiliser la chambre pectinal et le remplacement du goutte d'huile minérale pour chaque session d'enregistrement. Après la session d'enregistrement d'un jour donné est complet, enlever l'animal de l'enregistrement mis en place et effectuer un lavage de l'huile minérale. Specifically, ajouter une autre goutte (5 pi) de l'huile minérale dans la chambre, et enlever toute l'huile. Cela permet de minimiser la présence de stimulants résiduelle, qui peut avoir filtré de la pipette lors de la session d'enregistrement. Avant la prochaine session, ajouter une goutte d'huile comme décrit précédemment. 4. Les résultats représentatifs: Selon le matériel d'enregistrement utilisé (par exemple l'amplificateur particulier, la numérisation du matériel, etc), un résultat représentatif est un enregistrement extracellulaire avec un grand S: N ratio d'au moins 3:1. La construction réussie de la chambre de l'huile minérale est nécessaire pour isoler la stimulation chimique de sensilles individu, car il fournit un moyen d'offrir sapides chimiques polaires (à base d'eau) 8. S'il ya trop peu d'huile ou pas du tout, la solution stimulants se propage à partir du sensillum enregistrées à son sensilles voisins, ce qui est susceptible de provoquer une période prolongée, Bout incontrôlée de stimulation chimique 8.