Tek Hücre Transcriptome Analizi
概要
Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.
Abstract
Birçok gen ekspresyon analizi teknikleri heterojen toplumlarda kültür doku homojenatlarında veya hücreleri hücreleri izole malzeme güveniyor. 1,2,3 durumda beynin hipokampus gibi bölgelerin her biri, farklı hücre türleri ile karmaşık bir düzen içeren farklı mRNA profilleri. Hücre popülasyonlarının arasında ve içinde moleküler farklılıklar içine derinlemesine bir soruşturma daha fazlası için tek hücre hasat yeteneği sağlar. Biz daha fazla işlem için hücre hasat için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Genellikle elektrofizyoloji kullanılan Pipetler (aspirasyon kullanarak) bir ilgi hücre izole etmek için kullanılan ve moleküler biyoloji teknikleri herhangi bir sayı ile daha fazla işlem için elverişli bir Eppendorf tüp içine depozito. Bizim protokol dendritler hücre kültürü veya akut dilim bile tek tek hücrelerin hasat için modifiye edilebilir.
Ayrıca tek bir hücre izolasyonların büyük bir alt uygulama olarak Arna amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, ters transkripsiyon veya gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi diğer gen ekspresyon analizi teknikleri, alternatif olarak laboratuar tarafından geliştirilmiştir. 4,5,6,7,8 Bu teknik, doğrusal amplifikasyonu için sağlar polyadenylated RNA sadece malzeme femtograms ile başlayan ve antisens RNA mikrogram miktarlarda. Doğrusal amplifiye malzeme izole hücre transcriptome bileşenleri göreceli bolluk PCR üstel amplifikasyon daha doğru tahmin sağlar. Temel prosedür amplifikasyon iki tur oluşur. Kısaca, bir T7 RNA polimeraz promoter mRNA transkript oluşturulan çift zincirli cDNA içine dahil edilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon geceleme (IVT) reaksiyon sonra T7 RNA polimeraz çift telli cDNA birçok antisens transkript üretir yapılır. Ikinci turda bu süreci tekrarlıyor ancak başlangıç materyali bu yana bazı teknik farklılıklar ile antisense RNA. Amplifikasyon üç turda, ikinci turda tekrar standarttır. Genellikle, üretilen antisens RNA melezleşmiştir ve bir mikroarray tespit böylece biotinlenmiş nükleozid trifosfatlar kullanarak in vitro transkripsiyon reaksiyonu üçüncü turda yapılır. 7,8
Protocol
Discussion
Notlar ve Sorun Giderme
- Öncesi ve sonrası hedef hücreyi izole olduğunu gösteren görüntüler ve kalan penumbra bakir kaldı almak isteyebilirsiniz.
- Hasat gibi çok fazla çözüm pipet giriyor, 3 Luer-Lock parçaları yolu ve pozitif basınçlı tüp tutmak için şırınga pistonu kullanabilirsiniz. İstenilen ses işleme türüne göre değişir ama çoğu uygulama için en fazla 5 ul iyi olmalıdır.
Moleküler biyoloji teknikleri hakkında genel ipuçları
- Vortex tüm hisse senedi tüpleri ve bir tepki eklemeden önce onları aşağı döndürün. ASLA vorteks enzimler.
- Reaksiyonları, tampon uygun konsantrasyonda olmasını sağlamak için enzim eklemeden önce iyice karıştırın.
- Mümkünse stratacooler kullanarak -20 ° C'de enzim stokları tutun. Aksi halde, kullanımdan önce doğru kaldırmak buz üzerinde tutmak ve -20 ° C'ye kadar hemen dönmek
- Her zaman pipetleme hataları azaltmak için birden fazla reaksiyon hazırlarken ana karışımları olun. Örneklerin sayısına göre gerekli hacmi hesaplayın ve% 10-20 ekleyin.
- Mağaza RNA -80 ° C geciktirir bozulması. RNA asidik koşullarda oluşur RNA geciktirir apurination tampon depolanan en istikrarlı.
Arna Usul Genel Anahat
Şekil 4A Arna prosedürün ilk turda göstermektedir. T7-oligo (dT) astar poli-T kısmı, ilk iplikli tepki olarak, Polya kuyrukları bağlanarak mRNA türleri (uzun beyaz dikdörtgen) seçer. Ayrıca bazı microRNA polyadenylated ve bu yordamı Çekilecek. Ancak, daha da önemlisi, hücre içinde en bol RNA, ribozomal RNA'lar, olmaz. Bu oligo mRNA bir şablon olarak kullanarak tamamlayıcı iplikçik cDNA (uzun gri dikdörtgen) sentezlemek için Reverse Transcriptase için bir astar olarak davranır. T7, T7-oligo (dT) astar bölümü başlangıç mRNA dizisi antisens çerçeve T7 RNA polimeraz organizatörü içermektedir. Bu, daha sonra in vitro transkripsiyon tepki olarak kullanılır.
Daha sonra, önceki adımda oluşturulan mRNA / DNA hibrid mRNA gecikmeli iplikçik DNA sentezi oluşturulan Okazaki parçaları benzer RNA "primerler" (küçük beyaz dikdörtgenler) oluşturmak Rnase H tarafından kısmen hidrolize olur. DNA Polimeraz I, RNA parçaları, bir şablon olarak mRNA tamamlayıcı DNA kullanılarak asal DNA sentezi için kullanır. '3' sonraki RNA parçası, 5 ulaştığında nükleaz faaliyet ribonucleotides kaldırır ve deoxyribonucleotides ile değiştirir. DNA ligaz önde gelen iplikçik yedek tam olmayan herhangi bir ipliklerini Arter eklenir. T4 DNA Polimeraz RNA parçaları, DNA Polimeraz I oluşturarak ilk primerler olarak nerede görev alanları doldurmak için eklenen bir künt uçlu, çift tıklatın IVT reaksiyon gerçekleştirmeden önce arıtılarak cDNA mahsur.
IVT tepki olarak, T7 RNA polimeraz anlamda iplikli bir şablon olarak kullanarak çift cDNA telli ve sentezler antisens RNA molekülleri (uzun siyah dikdörtgenler) dahil T7 organizatörü bağlanır. Bu binlerce antisens RNA molekülleri her çift zincirli cDNA molekülü (Şekil 4A) üretildiği amplifikasyon adım olarak hizmet vermektedir.
Şekil 4B tasvir gibi ikinci turda, başlangıç RNA bu yana ilk turda biraz daha farklı bir ters transkripsiyon reaksiyonu ile başlar antisens (düz siyah dikdörtgen) ve T7-oligo tarafından hedef alındı polyadenylated kuyruk yoksun (dT) ilk turda astar. Bu nedenle, bu reaksiyon rastgele primerler (küçük gri dikdörtgenler) ve daha sonra denatüre RNA ile astarlanmalıdır. Ikinci iplikçik reaksiyon sonra önceki ters transkripsiyon tepki olarak oluşturulan anlamda RNA'nın 3 'ucuna poli-dizisi bağlanır T7-oligo (dT) astar ile astarlanmalıdır. Başka bir IVT reaksiyon ilk turda olduğu gibi aynı şekilde yapılır. Bu ikinci turda genellikle, tek bir hücre üç tur amplifikasyon elde etmek için en az bir kez tekrarlanır.
Uygulamalar
Biz bu yazıda olduğu teknikleri, uygulamalar çok sayıda tercüme edilebilir. Tek hücre izolasyonu protokol akut dilimler halinde kullanılmak üzere modifiye edilebilir. 14 teknik olarak daha zor olsa da bu alternatif hazırlanması, aynı ilkeler geçerlidir. Ayrıca, pipet boyutu biraz ayarlanır ise hücrelerin fizyolojisi kayıtları hasat fizyolojik çıkışları arkasında moleküler mekanizmaları iyi kontrollü bir soruşturma için izin vermeden önce yapılmış olabilir. Başka bir hafif bir değişiklik hücre soma süreçleri izole etmektir. Bu uygulama için 15, bir pipet ile hücre gövdeleri toplamak ve daha sonra yeni bir pipet yardımıyla geri dönün ve 100-300 tespit dendrit toplamakes veya toplama tüpünün başına aksonlar 16
Bir kez hücreler, aynı hücre popülasyonlarının içinde bile farklı ve karşılaştırmalar mRNA bollukları ve kompozisyonlar arasında yapılabilir, hasat edilmiştir. Üçüncü turda Arna içine biotinlenmiş-UTP birleştirilerek bu göreceli mRNA bollukları belirlemek için mikroarray analizi sağlar. Orijinal mRNA nüfusun kompozisyonu da yeni nesil sıralama kullanarak Arna işlemden sonra tespit edilebilir. Güçlendirilmiş Arna da, bir hücre tipi mRNA'ların tam bir set, ikinci hücre tipi fenotipi eski haline geçiş ikna etmek için farklı bir hücre tipi transfekte olduğu hücre fenotipi dönüşüm çalışmaları onaylamak için kullanılabilir bir prosedür laboratuvarı tarafından geliştirilen ve TIPeR olarak bilinen 17 Bu çalışmalar, hastalık durumları ve hücre fenotipleri ve bu tür çalışmaların eğitim için yararlıdır laboratuvarda halen devam etmektedir . RT-PCR veya qPCR hücre spesifik genlerin ifadesi onaylamak için güçlendirilmiş malzeme üzerine yapılabilir. Ayrıca, transfeksiyon veya transdüksiyon verimliliği tek hücre düzeyinde değerlendirmeler yapılabilir.
Avantajları ve Sınırlamalar
Soyut olarak belirtildiği gibi, analiz için tek hücre izolasyonu, heterojen hücre popülasyonlarının analizi ile görülen ortalama etkileri ortadan kaldırır. Bu ortalama etkileri tek bir hücre içinde bol transkript temsil eden ve ortalamayla çok düşük bolluğu transkript tespiti ve önlenmesi ile mRNA bollukları yanlış. Flow sitometri hücreleri tek tek sıralamak için kullanılan, ancak bu yöntem hücre spesifik belirteçler ve pahalı ekipman bilgisi gerektirir. 18 Lazer yakalama mikrodiseksiyon UV veya IR lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemleri ile ya da hatta tek bir hücre ve hücre içi çekim için izin ancak ilgi hücreleri gerektirir çok ince kesitler yüzeyinde bulunan 19 flow sitometri benzer, lazer yakalama mikrodiseksiyon da pahalı ekipman gerektirir.
Yukarıda açıklanan elektrot tabanlı toplama tekniğinin en önemli avantajlarından biri, değerli elektrofizyolojik veriler aynı hücre üzerinde yapılacak işlevsel ve transcriptome analiz için izin, hasattan önce ilgi hücre elde edilebilir 20 A tekniğin dezavantajı. mikromanipülatörler kullanarak gerektirir. Mikromanipülatörler ile tanıdık Araştırmacılar, bu tekniğin çok sezgisel bulacaksınız; Ancak, böyle bir deneyime sahip bireyler gerekli ince hareketleri ile rahat olmak gerekir.
Herhangi bir büyütme tekniği doğasında boyutu ve nükleotid kompozisyon dayalı belirli transkript tercihli büyütme. 4,6,7 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve cDNA hızlı amplifikasyon temelli teknikler transkript üstel amplifikasyon uçları (YARIŞ) Sonuç olarak, lineer amplifikasyon ise Arna amplifikasyon işlemi sonuçları. Böylece, Arna prosedürünün en önemli avantajlarından biri mRNA transkript bağıl bollukları sadece doğrusal katlanarak yükseltme karşı kuvvetlenme sürecinde meydana gelen herhangi bir hata ya da önyargıları büyüterek daha iyi korumak için onun yeteneği yatıyor hataları ve önyargıları söyledi.
Mikroarray analizi ile birleştiğinde Arna prosedürü benzer ya da farklı morfoloji, tedavi edilen veya tedavi edilmemiş tek hücreleri arasındaki mRNA bollukları karşılaştırma için izin verir. Ayrıca, yeni nesil sıralama için amplifiye malzeme teslim edilebilir. 5,8, prosedür için rastgele primerler kullanımı aksine, oligo-dT astarlanmalıdır prosedür önyargıları amplifikasyon yukarıda açıklanan beri Ancak, bu tür analizlerde dikkat edilmelidir 3 'mRNA ve genellikle her turda daha sonra güçlendirilmiş malzemeden hafif kısalma sona erer. Bakım mikroarray sonuçları analiz bazı yanlış yok çağrılar biraz kısaltılmış güçlendirilmiş malzemeden ortaya çıkabilir gibi standart yöntemleri ile alınmalıdır. Buna ek olarak, sıralama ise sonuç gerçekten de tam 5 sağlayacaktır 'en orijinal mRNA sıra, bazı mRNA 5' dizileri kaçırmış olabilir. Bu nedenlerden dolayı, ilâvelerle, mermi sayısı sınırlı olmalı.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Terri Schochet bu belgede yer alan resimler için hücre kültürlerinin sağlamak için, hücre kültürleri korumak için kaplama ve Kevin Miyashiro için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley ve Tiina Pertiz Arna prosedürü giriş için teşekkür ederiz. Bu çalışma için fon Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Ulusal Ruh Sağlığı ve Pennsylvania Topluluğu İnsan Kaynakları Gerçek Bulucu fonları Enstitüsü oldu.
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
| Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
| Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
| Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
| Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
| Boric acid | Sigma | B0252 | ||
| MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
| D-glucose | Sigma | G8769 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
| 1ml syringe | BD | 309628 | ||
| Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
| dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
| dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
| Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
| DTT | Supplied with second strand buffer | |||
| E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
| DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
| Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
| Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
| Random primers | BMB | 11034731001 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
| MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
| T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
| Rnasin | Promega | N251B | ||
| Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
| Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
| Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |
参考文献
- Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury. Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).
- Eberwine, J. Single-cell molecular biology. Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).
- Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity. The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).
- Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. Single neurons as experimental systems in molecular biology. Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).
- Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders. Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).
- Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications. Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).
- Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).
- Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration. Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126, 397-425 (1977).
- . . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2010).
- . . MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).
- . . Megascript kit. , 7-8 .
- . . MEGAclear kit. , 4-5 .
- Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. mRNA expression analysis of tissue sections and single cells. The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).
- Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).
- Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).
- Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q). Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).
- Vandewoestyne, M., Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. Int J Legal Med. 124, (2010).
- Eberwine, J., Bartfai, T. Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy. Pharmacol. Ther. , (2010).
