Транскриптома Анализ отдельных клеток
概要
В этой статье мы расскажем простой метод уборки отдельных клеток от первичных нейронов крысы культур и последующего анализа транскриптома использованием Арна усиления. Этот подход обобщению любого типа клеток.
Abstract
Многие методы анализа экспрессии генов зависят от материала изолированы из гетерогенных популяций клеток из ткани или гомогената клеток в культуре. 1,2,3 В случае с мозгом, такие регионы, как гиппокамп содержат комплекс расположение различных типов клеток, каждый из которых различных профилей мРНК. Способность урожая отдельных клеток позволяет более глубоко расследование молекулярные различия между странами и внутри клеточных популяций. Мы опишем простой и быстрый метод для уборки клетки для дальнейшей обработки. Пипетки часто используется в электрофизиологии используются для изоляции (с помощью аспирации) ячейки интерес и удобно поместить его в пробирку Эппендорфа для дальнейшей обработки с любым количеством методов молекулярной биологии. Наш протокол может быть модифицирован для урожая дендритов из культуры клеток или даже отдельные клетки от острого ломтиками.
Мы также опишем метод Арна усиления в качестве основного вниз по течению применение единых выделения клеток. Этот метод был разработан ранее в нашей лаборатории в качестве альтернативы другим экспрессии генов методов анализа, таких как обратный транскрипции или в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР). 4,5,6,7,8 Эта технология обеспечивает линейное усиление полиаденилированной РНК, начиная с только femtograms материала и в результате количество микрограмм антисмысловой РНК. Линейно усиленный материал обеспечивает более точную оценку, чем ПЦР экспоненциальной амплификации относительное обилие компонентов транскриптома из изолированных клеток. Основная процедура состоит из двух туров усиления. Короче говоря, Т7 РНК-полимеразы промоутер сайт включен в двухцепочечной кДНК, созданные из мРНК транскриптов. На ночь в пробирке транскрипции (ИВТ) реакции Затем проводится в котором Т7 РНК-полимеразы производит много стенограмм антисмысловых из двухцепочечной кДНК. Второй тур повторяет этот процесс, но с некоторыми техническими различиями поскольку исходный материал антисмысловых РНК. Это стандартная повторить второй тур, в результате чего три раунда амплификации. Часто, третий раунд в пробирке реакция транскрипции осуществляется с использованием биотинилированного нуклеозидтрифосфаты так, что антисмысловой РНК производства может быть гибридизированных и обнаруженных на микрочипов. 7,8
Protocol
Discussion
Замечания и устранение неисправностей
- Вы можете взять до и после изображения, показывающие, что клетки-мишени был изолирован и что остальные полутени остался нетронутым.
- Если слишком много решение вступает пипетки, как вы уборка урожая, вы можете использовать три способа Луер-Лок арматуры и поршень для шприца провести положительного давления в трубопроводе. Желаемую громкость будет меняться в зависимости от типа обработки, но до 5 мкл должно быть прекрасно для большинства приложений.
Общие советы по молекулярно-биологических методов
- Vortex весь запас труб и спина их, прежде чем добавлять к реакции. НИКОГДА вихрь ферментов.
- Тщательно перемешайте реакции перед добавлением ферментов, чтобы буфер при соответствующей концентрации.
- Держите фермента запасов при температуре -20 ° С, если можно, используя stratacooler. В противном случае удалите перед использованием, держать на льду, и немедленно вернуться до -20 ° C.
- Всегда убедитесь, мастер смешивает при подготовке более чем одной реакции на снижение пипетирования ошибок. Рассчитать объем, необходимый в зависимости от количества образцов и добавить 10-20%.
- Магазин РНК при -80 ° С до деградации ретард. РНК является наиболее стабильным, хранящиеся в буфере для замедления apurination РНК, которая происходит в кислой среде.
Общая схема процедуры Арна
Рисунок 4а показывает первый раунд процедуры Арна. В первой реакции пряди, поли-Т часть T7-олиго (дТ) грунтовка выбирает для мРНК видов (длинный белый прямоугольник), связываясь с полиА хвосты. Некоторые микроРНК также полиаденилированной и будет захвачен этой процедуры. Более важно, однако, наиболее распространенными РНК в клетке, рибосомальной РНК, не будет. Это олиго выступает в качестве грунта для обратной транскриптазы для синтеза комплементарной цепи кДНК (длинный серый прямоугольник) с использованием РНК в качестве шаблона. Часть Т7 Т7-олиго (дТ) грунтовка включает полимеразы Т7 РНК-промоутер в рамке с последовательностью антисмысловых в исходное мРНК. Это используется в конце реакции в пробирке транскрипции.
Далее, мРНК в РНК / ДНК гибридных созданный в предыдущем шаге частично гидролизуется РНКазы Н создания РНК "праймеров" (небольшие белые прямоугольники), аналогичные фрагменты Оказаки создан в отстающих синтеза ДНК. ДНК-полимераза I использует РНК фрагменты ДНК премьер синтеза с использованием ДНК дополняет мРНК в качестве шаблона. Когда она достигает следующий фрагмент РНК, его 5 'к 3' нуклеазы деятельности удаляет рибонуклеотидов и заменяет их дезоксирибонуклеотидов. ДНК-лигазы добавляется лигировать любые нити, где замена ведущих прядь не является полным. T4 ДНК-полимеразы добавляется для заполнения областей, в которых РНК фрагменты служили начальные праймеров для ДНК-полимеразы I создании тупыми концами двухцепочечной кДНК, который затем очищается перед выполнением реакции IVT.
В реакции IVT, Т7 РНК-полимераза связывается с промотором Т7 включены в двухцепочечной кДНК и синтезирует антисмысловых молекул РНК (длинные черные прямоугольники), используя смысловой нити в качестве шаблона. Это служит усиление шаг, в котором тысячи антисмысловых молекул РНК производится из каждой двухцепочечной молекулы кДНК (рис. 4А).
Второй тур, как показано на рисунке 4В, начинается с обратной реакции транскрипции, который немного отличается от первого тура с начала РНК антисмысловых (твердый черный прямоугольник) и не хватает полиаденилированной хвост, который был мишенью T7-олиго (DT) грунтовки в первом туре. Таким образом, эта реакция загрунтовать случайными праймерами (маленькие прямоугольники серый) и РНК впоследствии денатурированный. Вторая реакция нить затем загрунтовать по T7-олиго (дТ) грунт, который связывается с поли-последовательности в конце 3 'смысле РНК, созданного в предыдущем обратной реакции транскрипции. Другая реакция IVT осуществляется таким же образом, как и в первом туре. Это второй тур, как правило, не реже одного раза для достижения трех раундов усиления из одной ячейки.
Применения
Методы, которые мы представили в настоящей статье, может быть переведен на большое количество приложений. Единый протокол изолятор может быть модифицирована для использования в остром ломтиками. 14 Хотя технически более сложным, те же принципы применяются в этой альтернативной подготовки. Кроме того, если размер пипетки немного скорректированы, записи физиологии клетки могут быть сделаны до сбора урожая позволяет хорошо контролируемые исследования молекулярных механизмов, стоящих за физиологических выходов. Другая небольшая модификация для изоляции процессов из клетки сомы. 15 Для этого приложения, собирать клеточных тел с одной пипеткой, а затем вернуться с новым пипетки и собирать 100-300 определены dendritэс или аксонов в пробирку 16.
Как только клетки были собраны, сравнения мРНК содержания и композиции могут быть сделаны между разными и даже в пределах одной популяции клеток. Включение биотинилированного-UTP в третий раунд Арна позволяет микрочипов анализа для определения этих относительного содержания мРНК. Состав исходной популяции мРНК может быть определена после процедуры Арна использованием следующей последовательности поколения. Усиливается Арна также может быть использован для подтверждения клеточный фенотип преобразования исследований, в которых полный набор мРНК из одной ячейки типа трансфицировали в различных типа клеток, чтобы вызвать переход фенотип последний тип клетки в том, что из первого, Процедура разработана лабораторией и известной как TIPeR 17. Эти исследования особенно полезны для изучения болезненных состояний и клеточные фенотипы и такие исследования в настоящее время в лаборатории. RT-PCR или КПЦР может быть выполнена на усиленный материал для подтверждения выражение клеточной конкретных генов. Кроме того, оценка эффективности трансфекции или трансдукции могут быть сделаны на одном уровне клетки.
Преимущества и ограничения
Как указано в аннотации, изоляции отдельных клеток для анализа устраняет среднем эффекты, наблюдаемые при анализе гетерогенных популяций клеток. Эти эффектов усреднения искажать содержания мРНК в пределах одной клетки от чрезмерного представляющих обильные стенограммы и усреднения и предотвращения обнаружения многих странах с низким обилием транскриптов. Проточная цитометрия может быть использована для сортировки отдельных клеток, но этот метод требует знания клеточных маркеров и дорогостоящее оборудование. 18 Лазерная захвата микродиссекции либо с УФ-или ИК-лазерных систем захвата микродиссекции позволяют одной клетки и даже субклеточном захвата, но требует клетки, представляющие интерес для быть расположены на поверхности очень тонких срезов. 19 Как и в проточной цитометрии, лазерная захвата микродиссекции также требует дорогостоящего оборудования.
Одно из главных преимуществ электрода техника выполнения описанных выше коллекции является то, что ценные электрофизиологические данные могут быть получены из клетки интереса до сбора урожая, что позволяет функциональных и транскриптом анализа, который будет выполняться на той же клетке. 20 Недостатком нашей техники что это требует опыта, используя микроманипуляторами. Следователи знакомы с микроманипуляторами найдете эту технику очень интуитивным, однако, люди с такого опыта не придется привыкнуть тонких движений требуется.
Неотъемлемой частью любого усиления техника преимущественного усиления определенных стенограммы в зависимости от размера и нуклеотидного состава. 4,6,7 полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе методики, такие как обратный транскрипции полимеразной цепной реакции (ПЦР) и быстрой амплификации кДНК концами (RACE) приводит к экспоненциальному усилению стенограммы, в то время как усиление Арна процедура приводит линейного усиления. Так, одним из основных преимуществ процедуры Арна заключается в его способности лучше сохранить относительное содержание мРНК стенограммы только линейно усиливать любые ошибки или предубеждения, которые возникают в процессе усиления, а не экспоненциально усиливает сказал ошибок и предрассудков.
Процедура Арна в сочетании с анализом микрочипов позволяет сравнивать мРНК содержания между отдельными клетками одинаковых или разных морфологии, обработанных и необработанных. Кроме того, усиленный материал может быть представлен на следующей последовательности поколений. 5,8 Тем не менее, следует проявлять осторожность в таких анализов, поскольку, в отличие от использования случайных праймеров для процедуры, олиго-дТ загрунтовать процедуре, описанной выше предубеждения усиления 3 'концы мРНК и обычно приводит к незначительному сокращению последующих усиленный материал с каждым раундом. Следует проявлять осторожность при анализе микрочипов результатов со стандартными методами, как некоторые ложные отсутствуют звонки могут возникнуть в результате слегка укороченные усиленный материал. Кроме того, в то время как результаты секвенирования действительно обеспечивают полную 5 'последовательность большинство оригинальных мРНК, 5' последовательности некоторых мРНК может быть упущен. По этим причинам, количество раундов амплификации должно быть ограничено.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Спасибо Кевину Мияширо для гальванических и поддержания клеточных культур, доктору Терри Schochet для обеспечения клеточных культур для фотографии, включенные в этот документ. Кроме того, спасибо Кевину Мияширо, д-р Питер Бакли, и Тийна Pertiz для входа на процедуру Арна. Финансирование этой работы из Национального института по проблемам старения, Национальный институт по охране психического здоровья и прав Факт ресурсов Finder средств из штата Пенсильвания.
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Spiegelgas coverslips | Carolina Biological | 63-3029 | ||
| Nunc 35×10 mm culture dishes | Fisher | 12-565-90 | ||
| Water for cell culture | Lonza | 17-724Q | For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips | |
| Poly-D-Lysine MW70-150K | Sigma | 6407 | ||
| Laminin, ultrapure | BD Bioscience | 354239 | ||
| Boric acid | Sigma | B0252 | ||
| MEM with Earle’s salts and glutamax | Invitrogen | 41090-101 | For plating cells | |
| D-glucose | Sigma | G8769 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | ||
| Cytosine beta-D-arabinofuranoside | Sigma | C1768 | ||
| MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Invitrogen | 11095-098 | For growing cells | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
| Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) | Kimble Chase | 34500 99 | Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained. | |
| HBSS | Invitrogen | 14175 | Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+) | |
| 1ml syringe | BD | 309628 | ||
| Needle | BD | Gauge depends on the diameter of the pipettes | ||
| dNTP mix | Amersham | 28-4065-51 | ||
| dt-T7 oligo | Custom | Midland Certified | ||
| Second strand buffer (5x) | Invitrogen | Y01129 | ||
| DTT | Supplied with second strand buffer | |||
| E.coli DNA Ligase | Invitrogen | 100002324 | ||
| DNA polymerase I | Invitrogen | 100004926 | ||
| Rnase H | Invitrogen | 18021-071 | ||
| Megascript T7 kit | Ambion | AM1334 | ||
| Random primers | BMB | 11034731001 | ||
| Superscript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 56575 | in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT | |
| MEGAclear Kit | Ambion | 1908 | ||
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28206 | ||
| T4 DNA polymerase | Invitrogen | 100004994 | ||
| Rnasin | Promega | N251B | ||
| Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit | Ambion | AMIL1791 | ||
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-87 | Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook | |
| Micromanipulator | Olympus | Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models | ||
| Pipette Holder | Warner Instruments | MP-S15A | Will vary with micromanipulator and pipette O.D. | |
| Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 |
参考文献
- Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury. Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).
- Eberwine, J. Single-cell molecular biology. Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).
- Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity. The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).
- Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. Single neurons as experimental systems in molecular biology. Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).
- Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders. Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).
- Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications. Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).
- Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).
- Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration. Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126, 397-425 (1977).
- . . P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , (2010).
- . . MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , 28-29 (2004).
- . . Megascript kit. , 7-8 .
- . . MEGAclear kit. , 4-5 .
- Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. mRNA expression analysis of tissue sections and single cells. The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).
- Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).
- Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).
- Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q). Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).
- Vandewoestyne, M., Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. Int J Legal Med. 124, (2010).
- Eberwine, J., Bartfai, T. Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy. Pharmacol. Ther. , (2010).
