単一細胞のトランスクリプトーム解析

1。細胞の文化私たちの研究室では、以下の実験のための主要な神経ラット海馬培養を使用しています。以下は、これらの細胞培養が作成および管理する方法のための修正されたバンカーのプロトコルを説明します。9これらの細胞の培養技術の組み合わせの網羅的な数と提供する特定の研究室の特定のニーズに合わせた任意の確立された方法は、もちろん、ある細胞の一貫して健康的な供給は適切な代替となります。 五オートクレーブ、ラウンド、12mmのカバースリップを35 mmディッシュに配置されてから、水（細胞培養グレード）でリンスし、80μg/ mLのホウ酸緩衝液O / Nにおけるポリ- D -リジン（MW 70-150,000）でコーティングされていますホウ酸緩衝液O / Nでの1μg/ mLのラミニンでコーティングした後、水で再び洗浄する。 NGメディアは（グルコース（0.6％w / v）の補充したアールの塩とグルタミン、ペニシリン（100 U / mL）を、ストレプトマイシン（100μg/ mL）を、ウマ血清（10％v / v）をMEM）を加え、料理されインキュベーター（5％37 CO 2℃）に保存されます。 PDL150/lamininは、単層として成長する孤立したニューロンのための基質として機能します。カバースリップをメッキする前に2週間程度に被覆することができる。 メッキの日に、胎生18日ラット海馬からの一次ニューロンは、100,000細胞/ mLの懸濁液1.5 mLを加えることによってNGメディアでめっきされています。めっき後4〜6時間、各35 mmのディッシュは、任意の混入グリア細胞の増殖を防ぐために、5mMのシトシンβ- D -アラビノフラノシド（ARA – C）0.75μLで扱われます。 24時間後、メッキのメディアは、アールの塩類及びW / Vグルコース0.6％、1mMピルビン酸ナトリウム、及びB27を添加したL -グルタミンとMEMに変更されます。細胞は、プロセスの完全な開発を可能にするためにどんな実験で使用する前に、少なくとも2週間は成長することが許可されています。 2。準備ピペット RNaseが上の注意：皮膚、唾液、とさえ息がRNaseの主要な情報源、RNAを分解する酵素である。それは、RNaseフリーの技術は、サンプルはRNaseがで汚染され、その後低下しないようにするプロトコルで、この時点から観察されることが不可欠です。これは、常にサンプルや試薬を取り扱う際のサンプルや試薬を介して話を決して、手袋を着用し、滅菌ピペットチップとチューブの新しい箱を使用して含まれています。多くの場合、RNAの仕事のために排他的に指定されていないピペットは、RNaseのAWAY（モレキュラーバイオ製品）のようなRNase処理溶液を用いてそれらを拭くことにより除染されています。それはこれらの治療であなたのサンプルの汚染を防ぐためにも重要であるので、しかし、これらのソリューションは、ダウンストリームの酵素反応を阻害することになります。 オートクレーブ1.5ミリメートル外径（OD）ガラスピペット。 マイクロピペットプラーを使用して、あなたの引き手、フィラメント、及びピペットに基づいて異なる場合があります電気生理学的記録のための適切な直径、にピペットを引く。10口径は先端がセルのコレクションの前に壊れてしまうためあまり重要ではない。 慎重にヒントが（理想的にマイクロピペット保存瓶を使用して）そのまま継続される粉塵のない環境でピペットを格納する。 制御された方法で先端を打破するために、片手で指の間に緊張したキムワイプを持ち、非常にゆっくりと紙の1〜2回にわたってピペットの先端を磨きます。開口部は、標的細胞の大きさの約75から100パーセントにする必要があります。あなたが希望する結果が得られるまで、この手順を調整します。 3。準備文化、チューブ、および顕微鏡を1.7 mLエッペンドルフチュー​​ブの必要な数を準備します。材料は、単一セルの増幅、または収穫物の貯蔵用の他のソリューションで使用する場合はPBS、第一鎖の緩衝液2μLを加える。 収穫では、マイクロマニピュレータを搭載した40倍を目的とした光顕微鏡が必要になります。ホルダーから離れて大手フレキシブルチューブとピペットホルダーを使用してください。コレクション中にピペットの不要な動きを防ぐために安定した表面に貼ってチューブを。チューブの終わりには、ルアーロック接続1 mLシリンジは、ユーザー間で接続され、変更できるように針を挿入する。 カバースリップを使用している場合、一度にカバースリップで動作します。必要に応じて、*選択肢のPBSまたはメディアを含む新しい35mm皿に、単一のカバースリップを転送する。長い細胞がインキュベーター外の、より多くの不健康な人がなり、そのmRNAプロファイルよりは、健康な細胞のそれから離れることになります。それはそれで機能していないときにインキュベーターでそれらを保つことによって、他のカバースリップ上の細胞の健康を維持することが重要です。インキュベーターの外にあるセルで、可能な限り迅速に動作します。 実際の料理の壁がcoversliに向かってマイクロピペットの適切な進歩を可能にするために高すぎるので*我々のセットアップでは、35 mmディッシュの蓋を使用する必要があります頁 4。収穫セルマイクロピペットホルダーにマイクロピペットを固定します。マイクロマニピュレータのインサートに貼付マイクロピペットホルダー。 40倍の目標を設定します。 顕微鏡ステージ上に皿を置き、収穫に適したセルの領域を見つける。初代神経培養の場合には、細胞は周囲の細胞および/またはプロセスの収穫を防ぐために、その近傍から相対的に分離する必要があります。細胞体とプロセス間のmRNA転写産物の人口は、体細胞のmRNAに興味がある場合などのみ、プロセスと相馬の汚染を防ぐために注意すべきである、異なります。あなたが視野の中心に収穫したいセルを置きます。 光路に皿の解決に向けてマイクロピペットを進めるためにマイクロマニピュレーターを使用してください。溶液中にピペットチップを下げる。注射器を介して軽く吹いて、この時点から正圧を適用します。接眼レンズをのぞきながら。ピペットは、視野に影のように表示されます。それは粗い焦点ノブを使用してピペット先端のビューとフォーカスのフィールド内になるまでよく細胞の平面の上に、ピペットの先端の位置を調整します。ピペットの内径サイズが大きすぎるまたは小さすぎる場合は、この時点で、それを評価すべきである。練習の収穫は、適切な内径がこの時点で達成されたかどうかを判断する能力を提供します。 今、セルの平面に向かってピペットを進める。それは先端がそれはあなたが収集したいから地域に侵入する原因となって、あまりにも急いで進んでいないようにすることが重要です。これを防ぐために、マニピュレーターを用いて細胞へピペットの先端を進む前に、焦点面を進めるために粗フォーカスを使用してください。細胞とピペットチップの両方がフォーカスになるまでは、セルに近い場合、ファインフォーカスを使用してください。あなたがカバースリップのそれらを吹き飛ばす防ぐために、セルの平面に到達する前に正圧を印加停止します。 それはあなたが収穫する細胞体に触れているようにピペットチップを配置するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。 細胞がピペットの先端を入力するまでシリンジを使用して、口の中で穏やかな吸引を適用する。細胞がピペットを入力されていない場合は、カバーから持ち上げまで、そっと近づくのセルと下方向に先端を移動します。 5。セルを保存するすぐにソリューションから抜けたりピペットを移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。 ホルダーからピペットを取り外します。 片手には1.7 mLのエッペンドルフチュー​​ブを握り、ゆっくりと底に向かってチューブの側面にピペットの先端を破る。 （0.1 mLのマークを目指す。） チューブの中央に壊れたチップで、ピペットの上部開口部に1〜3 mLシリンジに取り付けられた針を挿入する。急速にチューブ内に噴出するためにピペットで溶液を強制的にプランジャーを押し下げる。セルは、ピペットの非常に先端に残る必要があり、これは正しくセルを追放するために十分なはずです。毛管現象がピペットに液体を戻すことができるように管の側面上の任意の液体に先端に触れないように注意してください。 すぐにデスクトップ遠心を用いてチューブの内容物をスピンダウンし、すぐに凍結（-80℃で保存）またはそれ以上の処理（が望ましい）のための氷上に置きます。 6。 aRNAの増幅ラウンド1第一鎖cDNA合成： 発現/ cDNAのハイブリッドを作成します。 単一のセルのコレクションのボリュームのすべての5μLのため、コレクションチューブ（氷上で）するには、次の1倍を追加。反応は（10μLコレクションボリューム、などのために2倍）大きいコレクションのボリューム用にスケールアップすることができます。エラーをピペッティングを考慮してコレクションチューブの数を加えた10〜20％以下の試薬を乗じてマスターミックスを作成します。 aRNAのa​​mpificationプロシージャ内のすべての次の反応にこれを行います。 ICE ON 1.2μLdNTPの（2.5mMの各） 2.4μL5倍のファーストストランドバッファー 0.3μLT7 -オリゴ（dT）プライマー（100 ng /μLの） 1.2μLDTT（100mMの） ヌクレアーゼフリー水で10.25μLにボリュームを起動します。簡単にマイクロを使用してピペットミックスとスピン。 70℃で5分間インキュベート° C mRNAのいずれかの二次構造を変性させる。すぐに、少なくとも5分間、氷上に置きます。 （再びマスターミックスを使用して）追加します。 0.3μLRNasin（40 U /μL） 0.45μLスーパースクリプトIII（200 U /μL） 1μLのヌクレアーゼフリー水ピペットで混合し、スピン簡潔に。 42℃で1時間インキュベート℃を ℃で15分間、上付き文字を不活性化するために70でインキュベートする。次の手順に進みます。 ラウンド1第二鎖cDNA合成合成Oを支援するために、mRNAの/ DNAハイブリッドのmRNAの部分からのRNAのプライマーを作成するfは二重鎖cDNA。 ICE ON 12μlの第一鎖の反応に、追加します。 8μLのヌクレアーゼフリー水 7.5μlの5倍第二鎖バッファー 0.75μLdNTPミックス（2.5 mMの各） 0.25μLDNAリガーゼ（10 U /μL） 1μLのDNAポリメラーゼI（10 U /μL） 0.25μLRNase H活性（2 U /μL） ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。 16歳で2時間インキュベート℃に追加：1μLT4 DNAポリメラーゼ（5 U /μL）。ピペッティングし、スピン短時間でミックス。 16℃でさらに10分インキュベートする。 11ウォッシュ2回500μLの洗浄緩衝液の代わりに750μLで1時間：わずかな修正では、メーカーの指示に従ってキアゲンアプライキットを使用して反応をクリーンアップします。ヌクレアーゼフリー水で溶出します。 Speed​​vacまたはエタノール沈殿によってを使用して2から4μLに集中する。エタノール沈殿の場合は、グリコーゲンが核酸キャリアとして機能し、DNAまたはRNAの少量を沈殿させるときに使用されます。酢酸ナトリウムからナトリウムは析出を助ける、DNA骨格の負電荷を中和するのに役立ちます。それは、ルーチンの沈殿のためのマスターミックスを作成する必要はありません。 29μLのDEPC水を加える 2μLグリコーゲン（5mg/mL） 1 / 10量（3μL）の3M酢酸ナトリウム 2.5倍量（〜250μL）冷100％エタノールよく混ぜる。 -80℃で沈殿° C（30分。O / Nへ）。 4℃で20分間遠℃に上清を除去し、800μL、70％エタノールでペレットを洗浄。完全にピペッティングあるいは過剰な塩分の除去を支援するために、ボルテックスのいずれかによってペレットが剥がれないようにしてください。 4℃でさらに20分間遠心℃を15〜20分間乾燥した上清と空気を取り外します。 ヌクレアーゼフリー水を4μLに懸濁します。 -20または-80℃で保存するか、次の手順に進みます。 in vitro転写ラウンド1（IVT）： 二本鎖cDNAに組み込まT7プロモーターからのアンチセンスRNAを合成する。 この反応は、代わりに20μLの反応を10μLのためにスケーリングを除いては、メーカーの指示に従ってアンビオンMEGAscript T7キットを使用して実行されます。12これは、室温でこの反応を組み立てることや、組み立ての際に、室温でバッファーを維持することが不可欠です。それは氷冷の場合、指定されたバッファは、DNAを沈殿する。使用しないときは、氷の上で次のNTPと酵素ミックスをしてください。 常温、 薄壁PCRチューブに再懸濁した二本鎖cDNAを転送します。 4μLNTPミックスを追加（18.75 mMの各） 1μL10 ×反応緩衝液 1μL10xの酵素ミックス 37℃で14時間のインキュベートしますサーモでC（望ましい）またはインキュベーター。 この反応は、Speed​​vacまたはエタノール沈殿を用いてサンプルの濃度に続く二つの異なる方法を使用してクリーンアップすることができます。キットを使用してクリーンアップするため、標準的なフェノール/クロロホルム抽出とクリーンアップの方法Aに進みます、方法Bに進みます方法： 500μLの洗浄緩衝液の代わりに750μlの1時間で2回洗浄する：いくつかの修正13で、製造元の指示に従って、Ambion社Megaclearキットを使用して反応をクリーンアップします。溶出のステップでは、列の中央にヌクレアーゼフリー水50μLを追加し、70℃で10分間インキュベートCを。 1分間10,000 gでスピン。新しいチューブに繰り返します。溶出液を組み合わせる。 Speed​​vacまたはエタノール沈殿によってを使用して2から4μLにサンプルを集中する。 エタノール沈殿のための：それは核酸と遊離ヌクレオチドの共沈を防ぐことで効率的なので酢酸アンモニウムは、このケースでは酢酸ナトリウムの代わりに使用されます。これは、NTPの下流の反応を阻害することができるのIVT反応で使用される高濃度のために重要です。 50μLDEPC水を加える 2μLグリコーゲン（20 mg / mLの） 0.6ボリューム（37.2μL）の5M酢酸アンモニウム 2.5倍量（〜180μL）の冷エタノール -80℃で沈殿° C（30分。O / Nまで）* 4℃で20分間遠℃に上清を除去し、（ヌクレアーゼフリーの水で）800μLを70％エタノールでペレットを洗浄。完全に過剰な塩分のすべてを削除するには、ペレットが剥がれないようにしてください。 4℃でさらに20分間遠心℃を上清と空気乾​​燥15〜20分を削除します。 4μLのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁します。 方法B： また、aRNAを標準のフェノール/クロロホルム抽出を使用してクリーンアップすることができます。 50μLDEPC水を加える 2μLグリコーゲン（20 mg / mLの） 0.6ボリューム（37.2μL）5M酢酸アンモニウム 1ボリューム（98μL）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール25:24:1（pHが7.8から8.0に平衡化） 15秒間ボルテックス。テーブルトップの遠心で半最大速度で1.5分間、遠心します。冷エタノールの2.5倍量（245μL）を含む新しいチューブに上部の水層を移す。 -80℃で沈殿° C（30分。O / Nへ）。 4℃で20分間遠℃に 800μLを70％エタノール（ヌクレアーゼフリーの水で）と上清と洗浄ペレットを削除します。完全に過剰な塩分のすべてを削除するには、ペレットが剥がれないようにしてください。 4℃でさらに20分間遠心℃を上清と空気乾​​燥15〜20分を削除します。 4μLのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁します。 *サンプルは、一晩インキュベーション中にこの温度で​​フリーズする場合があります。それは、これは実際には核酸の収量を増加させることができることが示されている。 第2ラウンド第一鎖cDNA合成 ICE ON 1μLランダムプライマー（0.05 mg / mL）に*を追加 70熱℃で10分間。すぐに、少なくとも5分間、氷上に置きます。 2μL5倍ファーストストランドバッファーを追加します。 1μLDTT（100mMの） 0.5μLdNTPの（2.5mMの各） 0.5μLRNasin（40 U /μL） 1μLスーパースクリプトIII（200 U /μL） ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。室温で10分間座ってすることができます。このステップは、逆転写反応が行われる前に、短いランダムプライマーの延長を可能にするために必要です。 42℃30分間インキュベート℃に 95℃でヒート5分° C DNA / RNAハイブリッドのRNAを変性させる。少なくとも5分間氷上に置きます。 -20℃で保存または-80 ° Cまたは直後に次の手順に進みます。 ランダムプライマーの*濃度は重要です。濃度が高すぎる場合、製品はより多くの増幅の各ラウンドで切り捨てられます。 第2ラウンド第二鎖cDNA合成 ICE ON 2μLT7 -オリゴ（dT）プライマー（μL/ 10 NG）*を追加 70℃で5分間熱すぐに、少なくとも5分間、氷上に置きます。簡単にスピン。 43.5μLのヌクレアーゼフリーの水を追加します。 15μL5倍第二鎖バッファー 1.5μLdNTPミックス（2.5 mMの各） 2μLDNAポリメラーゼI（10 U /μL） ピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。 16歳で2時間インキュベート℃に 2μLT4 DNAポリメラーゼ（5 U /μL）を追加するピペッティングにより完全に混和し、手短にスピン。 16℃でさらに10分インキュベートする。 セクション6.2.3のようにキアゲンアプライキットを使用して反応をクリーンアップします。 セクション6.2.8に6.2.4のようにSpeed​​vacまたはエタノール沈殿を2から4μLに集中する。 *第一ラウンド第二鎖cDNA合成に比べてT7 -オリゴ（dT）プライマーの異なる株式の濃度を注意してください。 in vitro転写で第2ラウンド第6.3節のように実行します。 セクションを何度も6.4から6.6希望の番号を繰り返します。なお、短いaRNAの製品の増幅の結果のそれぞれの後続のラウンド。増幅のラウンド数は、この理由のために制限する必要があります。通常は、増幅の2〜3ラウンドでは、マイクロアレイ解析を実行する単一の細胞から採取した材料を増幅するのに十分です。マイクロアレイ解析の場合には、第三ラウンドのIVT反応は、メーカーの指示に従ってイルミナTotalPrep RNA増幅キットを使用して実行されます。この手順では、マイクロアレイチップ上の検出に使用されるaRNAのにビオチン標識UTPを内蔵しています。 ナノRNAキットに光度計またはアジレントバイオアナライザを使用して第三ラウンドaRNAの濃度を測定する。 7。代表的な結果初代神経培養物からの単セルの成功の収穫は（図1を参照）適性に応じて、2分未満で完了することができます。しかし、収穫のための時間は、システム間で、実験操作が介在すると変化します。 （図4Aおよび4Bを参照）の合計増幅されたaRNAのマイクログラムの量で結果aRNAの手順に単一のセルを供するとバイオアナライザ（図3を参照）で分析するときに特徴的なブロードなピークを生成します。三回は、単一細胞の遺伝子発現の迅速な分析が可能、三日の最低で完了することができます。 図1。示されているのは単離ニューロンの豊作の一例です。我々は、セレ比較的低密度の領域を（）CTEDと、目的のセル（B）に向かってピペットチップを進めた。細胞が収穫された後にサード画像（C）は、ビューのフィールドを示しています。周囲のプロセスは、カバースリップ上に残っていることに注意してください。 図2。示されているのは効果的な収穫のための不適当な大きさのピペットチップの2つの画像です。これらのヒントは、不完全な収穫（A）と（B）はそれぞれ環境を周囲の収穫につながる。 図3バイオアナライザを使用して、次の収穫と増幅、解析が増幅されたRNAの分布や量を調べることをお勧めします。単一細胞の材料から成功した増幅、低マイクログラムで合計金額が得られますし、スムーズと広い分布を持つことになります。 図4。最初のラウンド（）の回路図とaRNAの手続きの第二ラウンド（B）が表示されます。