ヌクレオソームELISA(NU – ELISA)は、ネイティブ、無傷のヌクレオソームの調製品で、翻訳後修飾のグローバルなパターンを検出する高感度かつ定量的な方法です。これらの変更は、メチル化、アセチル化、および特定のヒストンのアミノ酸残基でリン酸化が含まれており、それ故にNU – ELISAは、特定の細胞型の総合的なクロマチンの修飾状態のグローバルプロテオミクスアッセイを提供する。
真核生物のゲノムは、DNAとタンパク質の両方を含むクロマチンとして存在する。クロマチンの基本単位は2つのヒストンH2A、H2B、H3、およびH4 1のそれぞれに関連付けられているDNAの146塩基対を含むヌクレオソーム、です。ヒストンのN末端尾部には、リジンとアルギニンに富み、アセチル化、メチル化、および他の翻訳後修飾(PTMS)によって転写後に変更されます。ヌクレオソームのPTMの構成は、このような性質2,3におけるエピジェネティックな遺伝子調節のモードを提供し、関連するDNAの転写活性に影響を与えることができます。我々はヌクレオソームELISA(NU – ELISA)は定量的に細胞から抽出したヌクレオソームのグローバルPTMの署名を決定するという方法を開発した。 NU – ELISAはウェスタンブロット法よりも感度が高く定量的であり、そして特定の細胞型のepiproteomic状態を調べるために便利です。このビデオジャーナルの記事では、NU – ELISA解析を実行する詳細な手順を示しています。
NU – ELISAは、特定の細胞型内に存在するヌクレオソームPTMSのグローバルステータスを確認する方法を提供する。 NU – ELISAの研究は世界的なヌクレオソーム変更の状態が発散細胞型4の比較で異なることが示されている。細胞はトリコスタチンA -またはときにマウスembyronicの幹細胞は4を差別化しているなどのエピジェネティックな調節剤にさらされているときに加えて、NU – ELISA PTMのプロファイルが変更されます。方法はまた、ヒトES細胞5のクロマチンを研究するために正常に適用されています。 NU – ELISAは、現在の形で、細胞のエピゲノムの合計内に存在するPTMSの唯一のコンポジット署名を検出することができるに注意する必要があります。これは、特定の遺伝子座における特定のPTMの分布を決定することができるゲノムワイドなクロマチン免疫沈降、と著しく異なります。
NU – ELISAの手順の最初のステップは、哺乳動物の核6,7からmononucleosomesを分離する従来の方法を適合させたもの。これらの適応の方法は、哺乳動物細胞から高品質の無傷mononucleosomesを得るために好都合な方法を提供し、得られた画分は、クロマチンコンテンツで包括的ですが、追加の核物質が大量に含まれています。特定の腹筋が使用されているので、混入非ヌクレオソーム材料は、高い純度を必要とする量産仕様のアプローチとは異なり、NU – ELISAアッセイで忍容性は良好です。しかし、NU – ELISAは、西部が西部劇とヌクレオソームPTMSの検出のための質量分析に優れた代替手段を提供するので、4ブロッティングよりも高感度かつ定量的です。
The authors have nothing to disclose.
NU – ELISA法の開発は、NIHの助成金RO1AG023687によってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | コメント |
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Micrococcal Nucleae | Sigma | N3755 | Make aliquots of 2 U/10μl buffer, stored at -20°C |
Nunc MaxiSorp Microtiter Plates | Fisher | 12-565-135 | Adhesive plate covers can also be ordered through Fisher |
Automated Plate Washer | |||
1-Step TMB-ELISA substrate | Pierce | 34028 | Store at 4°C pre-warm to RT before use or as directed on the specification sheet |
Microtiter Plate Reader | Bio-Rad microplate reader (model: 680) | Most colorimetric plate reader models are suitable |