単離骨格筋のミオ - 機械的分析

プロトコルは、UCSF動物実験の承認を得て実施し、委員会（IACUC）を使用しています。 1。マウス指伸筋の筋 （EDL）筋肉の解剖制度的なガイドラインに従って、すべての動物の手順を実行します。 筋肉の収穫は10〜直前に200 mg / kgを腹腔内子宮頸部/ペントバルビタール脱臼で動物を安楽死させる。解剖はよく筋肉が安楽死の15分以内に収穫し、緊張の変換器でマウントできるように練習してください。 解剖のトレイとトレイのピン脚の上で死体の仰臥位を手配する。 解剖顕微鏡、開いている皮膚、慎重に開いている筋膜（ 図1A）、そして足首から脛骨皮の下にEDL（ 図1b）を公開する上方。筋肉がしっとりと収穫の間にバッファを維持するために乳酸リンゲル液の滴を使用してください。 EDLを削除する、それぞれの端に、できるだけ多くの腱として維持し、及び乳酸リンゲル液を含むペトリ皿に入れ。筋肉の腱（Fig.1C）の各々に縫合糸を接続します。それは筋肉の繊維が触れたり、解剖時に邪魔されないことが不可欠である。 2。筋肉のストリップミオグラフでマウスのEDLの取付けこれらの研究のために、組織の風呂は、それが連続的な酸素化と一定の温度で生理的溶液中で入浴しながらことは筋肉を固定して必要とされる。お風呂は、筋肉の緊張の測定のための力変換器で結合されている。我々はこの目的のためにデンマークのミオテクノロジー（DMTモデル820MS）から統合された筋肉のストリップミオグラフバスを採用しています。さらに、方形パルス電気刺激装置（グラスモデルS48）とデータ収集プラットフォーム（ADInstruments PowerLabデータ収録システムとLabChartソフトウェア）はそれぞれ、ミオ機械的応答を記録して分析、引き出すために必要とされる。 DMT 820MSは、筋肉のストリップの中間部分で、筋肉の両側に配置されているチャンバーカバーに統合された白金電極を持っています。他のmyographsは、電極の配置に固有の注意が必要な場合があります。 5mLのクレブスヘンゼライト溶液11にミオグラフバスを埋める。 25℃くらいまで温め使用前に15分間入浴を通じてバブルO 2 / CO 2（95％/ 5％）。 ミオグラフのクランプ間にEDLを拡張し、クランプ間EDL筋肉の腱（Fig.1D、E）を確保するために縫合糸を使用してください。筋肉自体を固定しないように注意してください。 25℃ミオグラフバスを維持℃に 3。ミオ – 機械的分析 A.の単収縮張力は筋肉の弛緩がないように槽内の初期の長さを設定します。 、最大の単収縮張力を得るために電圧を調整することによって、最大刺激（持続時間は0.5 ms）を決定するには、その後、最大上記の20％（最大上刺激を達成するために）で刺激を設定します。我々の研究では、最大上刺激は通常40ボルトの出力で達成される。 オシロスコープを使って刺激からの出力を確認します。 単収縮張力にはさらなる増加がなくなるまで徐々に筋肉をストレッチすることにより最適な長さを決定します。 筋肉は3分間平衡させる。 最大上の正方形グラスS44電気刺激装置を使用して最適な長さの刺激（0.5ミリ）、およびレコードの出力を提供します。 レコード：単収縮張力曲線（P T対時間、Fig.2A）。 B.破傷風緊張筋肉は3分間休息することができます。 グラスS44電気刺激装置を使用して最適な長さで150 Hzで300ミリ秒のための最大上刺激の列車、およびレコードの出力を適用する。 レコード：破傷風の張力曲線（P O対時間、 図2b）。 C.フォース周波筋肉は3分間休息することができます。 力周波数：それぞれの刺激（ 図3）の間に、残り3分で30、60、100、140、および160 Hzで最大上刺激の列車を適用する。また、電車は15、25、35、45、55、65、75、100、140と低い周波数での分解能は160 Hzの、力の変化が、実質的に適用されることがあります。 プロット：力 – 周波数の関係（％最大力対刺激の周波数）。 D.疲労短い破傷風菌の列車を適用する：300ミリ秒（または周波数ピーク力の50％を生産するように調整）は60 Hz、10分間毎に3秒。 10分では、破傷風の力は初期値（ 図4）の〜15％のプラトーレベルに低下するはず。 プロット：低周波疲労（％最大の力対時間）。 プロトコルの最後にE.追加のデータ収集ミオグラフから筋肉をアンマウントする前に、MUSCを設定するルは、最適な長さでステップIII.A.4で決定され、顕微鏡やキャリパーのいずれかで眼を使用して、その直径を測定するように。断面積（μmの2）を計算する。 縫合糸を除去し、筋肉を比較検討することによって筋肉の質量（mg）を測定。 本体質量（GM）を評価するためにマウスを量る。 4。計算筋肉：ボディの質量比= 筋肉量/ボディ質量単収縮張力、P T（MN）= けいれん時に生成される最大張力特定の単収縮張力（N / cm 2）と= 単収縮張力（MN）/断面積（μm2と ）× 10 5 N / MN•μmの2 / cm 2で ピーク張力の時間（ミリ秒）= 最大張力の収縮の発症からの時間ハーフ緩和時間（ミリ秒）= ピーク張力のピーク張力の50％までの時間強縮張力、P O（MN）= 破傷風中に生成される最大張力特定の強縮張力（N / cm 2）と= 強縮張力（MN）/断面積（μm2と ）× 10 5 N / MN•μmの2 / cm 2で 破傷風の上昇の最大速度（N / S）= 破傷風、すなわち、強縮張力曲線（または、DP O / DT）の最大傾斜でテンション上昇中の緊張の増加の最大速度ハーフ緩和の強縮張力（MS）= 刺激の停止からの刺激の終了時に緊張の50％までの時間単収縮張力から強縮張力の比、P、T / P O = 最大単収縮張力/最大強縮張力疲労指数= 最大等尺性張力の低周波疲労の2分後の張力の比 5。代表的な結果 図1。 EDL筋肉の解剖。後肢muscles.TA、前脛骨筋。B、EDLの露出（指伸筋屈筋）筋肉の、露出。C、EDL腱の縫合糸の添付ファイル。D、テンショントランスデューサバス（側面から見た図）。E、EDLはお風呂にマウント（上記から表示）。の筋肉は、不完全に例示目的のためのバッファーに浸漬し、実際には、筋肉が完全に乾燥から防ぐために浸漬する必要があります。 図2。張力曲線の例。最大の単収縮張力（P t）は、収縮時間（CT）とハーフ緩和時間（HRT）を示す単収縮張力曲線の、例。バー、1S。B、最大強縮張力を示す強縮張力曲線（P O）の例とハーフ緩和の強縮張力（HRTT）。バー、1S。 図3。力周波数の関係の解析の例。増分刺激の周波数で生成される、緊張が。B、30MHzの。バー、80ミリ秒。C、140MHzでパルス列の例でパルス列の例。バー、80ミリ秒。D、に示されているデータから得られる力周波数の曲線の例。力周波数の曲線の形状は筋肉の強さの特徴である、と別の動物から筋肉の間で比較することができます。 図4。低周波数の疲労解析の例。 、指示された時点（B、C、D）でのパルス列の低周波stimulation.Examplesの期間に生成された減分の緊張を以下に示します。Eは、に示されているデータから得られる低周波疲労曲線の例。低周波数の疲労曲線の形状は筋肉の強さの特徴である、と別の動物から筋肉の間で比較することができます。