离体骨骼肌肌的力学分析
1Cardiovascular Research Institute,University of California San Francisco, 2小児科,University of California San Francisco, 3生物学科,San Francisco State University, 4医学部,University of California San Francisco , 5Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine & Stem Cell Research,University of California San Francisco
概要
为了评估<em>在体内</em>肌肉疾病的治疗性干预的影响，方法是需要定量力量的产生和治疗肌肉疲劳性。我们详细评估explanted小鼠后肢肌肉的肌力学性能的方法。这种分析提供了一个强大的方法，以定量的影响肌肉功能的基因改造，以及在治疗肌肉疾病的小鼠模型的比较。
Abstract
在体内治疗肌肉疾病1,2,3的治疗干预的影响评估，定量分析方法，测量力的产生和治疗肌肉疲劳性。我们描述了一个新鲜explanted从小鼠后肢肌肉中的肌机械性能评估的详细方法。我们描述了小鼠趾长伸肌肌肉的非创伤性的收获，安装的肌肉，在肌肉地带肌动描记器（型号820MS;丹麦MYO技术）和最大抽搐，强直张力，收缩时间，半弛豫时间的测量，使用方波脉冲刺激器（型号S48;草技术）。使用这些测量，我们展示了具体的抽搐和规范化肌肉的横截面积，抽搐，强直紧张的比例，力-频率关系曲线和低频疲劳曲线 4强直张力的计算。这种分析方法提供了一个为1,2,3,5肌肉疾病的小鼠模型，以及治疗干预的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响比较之间的定量比较。
Protocol
加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准该协议。 1。鼠标趾长伸肌 （EDL）肌肉的解剖按照机构准则执行的所有动物的程序。 安乐死与200 mg / kg腹腔巴比妥/颈椎脱位，肌肉收获10前的动物。剥离应实行，使肌肉可收获和“安乐死”的15分钟内，安装在张力换能器。 夹层纸盒和引脚腿到托盘上排列胴体仰卧。 在解剖镜下，开放的皮肤，小心地打开筋膜（图1a），和剥离胫骨从脚踝向上暴露的EDL（图1b） 。使用滴乳酸林格氏液，以保持肌肉湿润和收获期间的缓冲。 删除的EDL，保留尽可能多的肌腱上，每年年底，并把到一个Petri菜含有乳酸林格氏液。铁缝合肌腱（ 图1c）。重要的是，肌纤维不能触及，或在清扫不安。 2。鼠标EDL的安装在肌肉地带肌动描记对于这些研究中，一个组织洗澡是需要的，固定的肌肉，同时允许它在恒温沐浴在生理溶液中连续充氧。洗澡加上一个力传感器的测量肌肉紧张。我们采用从丹麦MYO技术（DMT型号820MS）的综合肌肉地带肌动描记洗澡为此。此外，一个方形脉冲电刺激（草型号S48）和数据采集平台（ADInstruments PowerLab系统的数据采集系统和LabChart软件）引出，记录和分析MYO机械的反应，分别需要。大唐820MS集成到盒盖定位肌肉两侧肌肉地带中旬部分，铂电极。其他myographs可能需要特别注意电极放置。 肌动描记浴填写5毫升克雷布斯Henseleit解决方案11。加热至25 ° C。泡泡O 2 / CO 2（95％/ 5％），通过洗澡前15分钟使用。 使用缝线的EDL肌动描记夹具之间的延长和夹具之间的EDL肌筋（Fig.1D五 ）安全。要小心不要夹肌肉本身。 肌动描记浴保持在25 ° C。 3。肌的力学分析 A.抽搐紧张在洗澡时设置的初始长度，以便有没有肌肉松弛。 确定通过调整电压，以获得最大的抽搐紧张的最大刺激（持续时间为0.5毫秒），然后设定在20％以上最大的刺激（实现超最大刺激）。在我们的研究，超最大的刺激，通常在40伏的输出实现。 验证从使用示波器的刺激输出。 确定最佳长度逐渐伸展的肌肉，直到没有抽搐的紧张局势进一步增加。 允许3分钟的肌肉平衡。 交付平方米超最大的刺激在最佳使用电子刺激S44草的长度（0.5毫秒），并记录输出。 记录：抽搐张力曲线（P T随时间; 图2A）。 B.破伤风紧张让肌肉休息3分钟。 应用最佳使用电子刺激S44草的长度在150赫兹的超最大刺激的列车为300毫秒，并记录输出。 记录：破伤风张力曲线（P O随时间; 图2B）。 C.部队频率让肌肉休息3分钟。 部队频率：适用于30，60，100，140和160赫兹的超最大刺激的列车，彼此之间的刺激（图3）休息3分钟。此外，火车可应用于15，25，35，45，55，65，75，100，140和160赫兹在较低的频率更高的分辨率，其中力变化显着。 剧情：力频率的关系（％最大力量与刺激频率）。 D.疲劳应用短破伤风的火车：300毫秒（或调整，以产生50％的峰值力的频率），每10分钟3秒60赫兹。 10分钟，强直力下降的一个〜15％的初始值（ 图4）高原水平。 剧情：低频疲劳（％最大力量与时间）。 E.在协议结束额外的数据收集在卸载肌肉的肌动描记之前，设置MUSC乐在最佳长度确定的步骤III.A.4，使用显微镜或一个眼，用游标卡尺测量其直径。计算截面积（2微米）。 通过去除缝线，体重肌肉测量肌肉质量（毫克）。 称重鼠标评估体重（GM）。 4。计算肌肉：体重比= 肌肉质量/体质量抽搐紧张，P T（MN）= 在抽搐产生的最大张力具体抽搐张力（N /厘米2）= 抽搐张力（MN）/截面积（2微米）× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 到峰值张力时间（毫秒）= 从收缩发病时间最大张力半弛豫时间（毫秒）= 从峰值紧张到峰值张力的50％ 强直紧张，P O（MN）= 在破伤风产生的最大张力具体强直张力（N /厘米2）= 强直张力（MN）/截面积（2微米）× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 破伤风上升最大速率（N / S）= 期间，破伤风，即紧张，强直张力曲线的最大斜率（或DP的O / DT）上升的紧张局势加剧的最高税率半松弛强直张力（MS）= 时间从停止刺激，在紧张刺激终止的50％ 抽搐紧张强直张力比，P – T / P O = 最大抽搐张力/最大强直张力疲劳指数= 经过两分钟的低频疲劳等长张力最大的张力比 5。代表性的成果 图1。剖析的EDL肌肉。 EDL的一个 muscles.TA，后肢胫前，B，EDL（趾长伸肌）肌曝光，曝光C，EDL的肌腱缝合的附件，D，张力传感器浴（从侧面看），E，安装在洗澡（从上面）。在肌肉未完全沉浸在缓冲区，仅供;在实践中，应完全沉浸肌肉，防止干燥。 图2。张力曲线的例子 。 的抽搐紧张说明抽搐最大张力（P T），收缩时间（CT）和半弛豫时间（HRT）的曲线，例如酒吧，1秒，B，强直张力曲线显示最大强直张力（P O）的例子，半松弛强直张力（HRTT）。酒吧，1S。 图3。力频率的关系分析的例子 。 ，增量刺激频率产生的紧张局势，B，例如，在30MHz的脉冲序列。酒吧，80毫秒，C，例如，在140MHz的脉冲序列。酒吧，80毫秒，D，从A 中显示的数据派生的力-频率曲线的例子。力 – 频率曲线的形状是肌肉力量的特点，可以比较来自不同动物的肌肉之间。 图4。低频疲劳分析的例子 。超过stimulation.Examples在指定的时间点（B，C，D）的低频脉冲串期间产生了递减的紧张局势图所示，E，从 A中显示的数据产生的低频疲劳曲线的范例。低频疲劳曲线的形状是肌肉力量的特点，可以比较来自不同动物的肌肉之间。
Discussion
我们描述了一个详细的评估，在explanted从小鼠后肢肌肉的肌机械性能的方法。 EDL的，而更难以解剖，因为其背后的胫前肌后的位置，比胫前，因为其突出的腱附件的脚踝和膝盖关节更容易评估。这些筋便于安装在肌肉地带肌动描记。相反，更容易访问的胫前在膝关节广泛，几乎atendinous附件，异常艰难的两个剖析不影响肌肉的前提下，并安装在肌动描记安全。我们还指出，迅速安装在生理缓冲液和温度中的含氧浴肌肉，保持肌肉的力学性能是必不可少的。我们发现，我们可以长达30分钟重复这种分析没有显着变化，在这种条件下肌肉反应。最后，它是必不可少的，肌纤维不被感动在解剖和安装程序，可以有肌肉功能上的不利影响，并导致低估肌机械力。遵循这些程序，这种分析提供了可靠的定量方法来评估的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响，以及在肌肉疾病的小鼠模型1,2,3,5治疗性干预之间的比较。
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持公共卫生服务津贴（HL086513）从NHLBI私立教育机构，以及来自加州再生医学（RC1 – 00104），公共卫生服务津贴（HL085377）从NHLBI研究所的综合研究资助和礼品波林基金会HSB
资深大律师是一个加州再生医学的桥梁研究所的支持干细胞研究奖（TB1 – 01194）旧金山州立大学。
Materials
| Material Name | タイプ | Company | Catalogue Number | Comment |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery | |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery | |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery | |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery | |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis | |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction | |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery | |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation | |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia | |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition | |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation | |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media
Lactated Ringer’s solution
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH(OH)COONa (sodium lactate)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl2 2H2O (calcium chloride dihydrate)
- adjust pH to 6.75
Krebs Henseleit solution
- 118 mM NaCl
- 4.7 mM KCl
- 1.25 mM CaCl2
- 1.2 mM MgCl2
- 1.2 mM KH2PO4
- 25 mM NaHCO3
- 11 mM glucose
- adjust pH to 7.2-7.4 by equilibrating with O2/CO2 (95%/5%) gas
Pentobarbital
- 5 mg/ mL working solution in sterile water
参考文献
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
タグ
Myo-mechanical AnalysisIsolated Skeletal MuscleTherapeutic InterventionsMuscle DiseaseQuantitative MethodsForce GenerationFatigabilityHindlimb MuscleExplanted MuscleMuscle Strip MyographMaximal Twitch TensionTetanic TensionContraction TimeHalf-relaxation TimeSquare Pulse StimulatorSpecific Twitch TensionSpecific Tetanic TensionMuscle Cross-sectional AreaTwitch-to-tetanic Tension RatioForce-frequency Relationship CurveLow Frequency Fatigue CurveComparison Between Therapeutic InterventionsMouse Models Of Muscle DiseaseGenetic ModificationMuscle Function
