Ein einfacher Weg zu Ethanol Empfindlichkeit in Flies Measure

1. Erstellen der Bestrahlungskammer Schneiden Sie ein Fläschchen Stecker in zwei Hälften mit einer Rasierklinge. Alternativ können Sie auch Wattebäusche. Schieben Sie das Fläschchen Plug Hälfte oder die Watte, auf den Boden eines Lebensmittels Fläschchen um eine glatte Oberfläche, dass Fliegen nicht in. stecken machen Wenn Sie mehrere Exposition Kammern, stellen Sie sicher, dass die Fläschchen Plug-and-Food bis zu dem gleichen Volumen in jeder Kammer. Eine Markierung auf der Seite der Flasche kann dies erleichtern. 2. Offenlegen der Fliegen Sammelt 8 fliegt von einem Geschlecht, Alter 1-5 Tage, dem Tag vor der Bestrahlung in regelmäßigen Essen Fläschchen ohne Hefe. Label sie im Code, so dass der Experimentator den tatsächlichen Genotyp / Stamm ist geblendet. Übertragung der acht fliegt in die Exposition Kammern durch Antippen. Nicht zu betäuben. Fügen Sie eine kleine Menge der Nahrung Farbstoff, zB Acid Blue 9, bis 200 Proof Ethanol, damit es gut sichtbar. Streichen Sie die Unterseite einer Flasche Stecker, oder Wattebausch, mit 0,5 ml Ethanol. Legen Sie die Ethanol-Stecker in die Exposition Durchstechflasche. Stellen Sie sicher, dass der Alkohol in das Fläschchen, und nicht gegen die Wand der Durchstechflasche nach. Starten Sie einen Timer auf. 3. Rekord Ethanol-induzierten Rausch Jede Minute, nachdem der Timer gestartet wird, tippen Sie auf die Exposition Kammer auf der Bank, um die Fliegen zu erschrecken und zu beobachten sie für 10 Sekunden. Notieren Sie die Anzahl der stationären Fliegen für jede Minute. Fliegen sind stationär, wenn sie nicht aussteigen dem Rücken, an einem Ort bleiben, oder schnell zu vibrieren ihre Flügel über den gesamten Zehn-Sekunden-Beobachtung-Periode. Letzterer fliegt gelten als stationäre, weil die überwiegende Mehrheit dieser fliegt stationär zwischen den Perioden des schnellen Flügel Bewegung sind. Fliegen sind nicht stationär, wenn sie aussteigen dem Rücken und zu Fuß entfernt und / oder bis das Fläschchen Wand. Eine Exposition Studie ist abgeschlossen, wenn 4 oder mehr Fliegen als stationäre aufgezeichnet. Entsorgen Sie fliegt und lassen Sie die Belichtung Kammer Luft für die spätere Wiederverwendung. 4. Bestimmen Sie die Zeit auf 50% Sedierung Die Zeit bis zu 50% Sedierung (ST50) ist die Zeit nach dem Start der Ethanol-Exposition, wenn vier der acht fliegt stationär bleiben. Dieser wird wie folgt bestimmt: Entweder: die erste Messung Minute, wenn genau vier fliegt stationär sind. Oder: wenn weniger als vier Fliegen (Y1) sind an einem Zeitpunkt (Minute X), und mehr als vier (Y2) bei der nächsten Messung Zeitpunkt (Minute X +1), dann linear interpoliert die ST50 mit Hilfe der Formel stationär: ST50 = (4 – Y1) / (Y2 – Y1) + X 5. Wiederholen Sie die Exposition gegenüber Toleranz zu bestimmen Offenlegen der Fliegen Bestimmen Sie die ST50 (wt) für die Wildtyp-Kontrollstamm in Ihrem Experiment verwendet. Setzen Sie den experimentellen Gruppen von Fliegen zu Ethanol wie oben beschrieben. Messen Sie ihre ST50 (1), aber weiterhin aussetzen, bis Sie die Zeit, 2x ST50 (wt) zu erreichen. Übertragen Sie die fliegt zurück in ein leeres Fläschchen Nahrung, und halten Sie für 4 Stunden. Re-Setzen Sie die Fliegen, und bestimmen Sie die ST50 (2) der Exposition 2. Bestimmen Toleranz Berechnen Toleranz in% (ST50 (2) / ST50 (1) – 1) x100. 6. Repräsentative Ergebnisse: Sehen Sie hier sind einige repräsentative Ergebnisse, die wir mit 6-8 Fläschchen Fliegen pro Genotyp und Dosis erhalten. Wenn Ihr Standardfehler ist wesentlich größer, dann ein systematisches Problem wahrscheinlich aufgetreten. Stellen Sie sicher, dass das Ethanol in die Exposition Kammern Gesichter, und dass die Kammern das gleiche Volumen sind. Abbildung 1. Dosis-Wirkungs-Kurve von Wildtyp-Fliegen auf steigende Prozentzahlen von Ethanol ausgesetzt. Acht Fläschchen Fliegen wurden pro Dosis und Geschlecht ausgesetzt. Männliche und weibliche Fliegen zeigen die gleichen ST50 bei jeder Dosis (p> 0,22, 2-Wege-ANOVA), während die ST50 über Dosierungen sinkt signifikant mit steigenden Ethanol-Dosis (p <0,001). Beachten Sie, dass aus überfüllten Flaschen fliegen kann wesentlich kleiner als jene von gesunden Flaschen, und dies Größenunterschied kann die ST50 beeinflussen. Seed jede Flasche mit 15-20 Frauen über 1-2 Tage, um eine optimale Larven Dichte pro Flasche zu bekommen. Abbildung 2. Exposing fliegt entweder 90% oder 100% Ethanol gibt den zuvor beschriebenen Ethanol-Widerstand durch den weißen rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-Wege-ANOVA) verursacht. Abbildung 3. Repeat Exposition gegenüber 100% Ethanol, im Abstand von 4 Stunden recovery interval, führt zu einem deutlichen Anstieg der ST50 nach dem zweiten Exposition (p <0,001, gepaarter t-Test). Beachten Sie, dass die Fliegen für 24 Minuten wurden während der ersten Exposition (entsprechend auf das Doppelte ihrer na ve ST50) ausgesetzt. Exposure für einen kürzeren Zeitraum (12 Minuten) nicht zu einem signifikanten Anstieg in ST50 bei wiederholter Exposition (Daten nicht gezeigt).