Een eenvoudige manier om Ethanol Gevoeligheid meten in Flies

1. Het creëren van de blootstelling kamer Snijd een flesje plug in half met behulp van een scheermesje. U kunt ook katoenen ballen. Duw de stekker half flesje, of de katoenen bal, naar de bodem van een levensmiddel flesje om een ​​glad oppervlak dat vliegen niet vast komen te zitten binnen te maken Als het maken van meervoudige belichting kamers, zorg ervoor dat de flacon plug en voedsel nemen hetzelfde volume in elke kamer. Een markering op de zijkant van de flacon kan vergemakkelijken. 2. Het ontmaskeren van de vliegen Verzamel 8 vliegen van het ene geslacht, leeftijd 1-5 dagen, de dag voor de blootstelling in de reguliere voeding flacons zonder gist. Label ze in code, zodanig dat de experimentator is blind voor de werkelijke genotype / stam. Breng de acht vliegt in de belichting kamers door te tikken. Niet verdoven. Voeg een kleine hoeveelheid voedsel kleurstof, bijvoorbeeld zuur blauw 9, tot 200 bewijs ethanol te maken goed zichtbaar. Smeer de bodem van een flesje of de stekker of watje, met 0,5 ml ethanol. Steek de stekker in ethanol de belichting flacon. Zorg ervoor dat de alcohol wordt geconfronteerd in de flacon, en niet naar de wand van de flacon. Start een timer te tellen. 3. Record ethanol geïnduceerde intoxicatie Elke minuut nadat de timer is gestart, tikt u de belichting kamer op de bank om de vliegen schrikken en hen te observeren gedurende tien seconden. Noteer het nummer van stationaire vliegt voor elke minuut. Vliegen zijn stationaire als ze niet kunnen krijgen van hun rug, blijven op een locatie, of snel hun vleugels trillen in de gehele tien seconden observatie-periode. Deze laatste vliegen worden beschouwd als stationair, omdat de overgrote meerderheid van deze vliegen zijn stationair tussen de perioden van snelle vleugel beweging. Vliegen zijn niet stationair als ze kunnen krijgen van hun rug en lopen en / of de flacon muur. Een blootstelling proces is voltooid wanneer vier of meer vliegen worden opgenomen als stationair. Gooi vliegt en laat de blootstelling kamer lucht uit voor later hergebruik. 4. Bepaal de tijd om 50% sedatie De tijd om 50% sedatie (ST50) is de tijd na de start van de ethanol blootstelling toen vier van de acht vliegen stil blijven staan. Dit wordt als volgt bepaald: Ofwel: de eerste meting minuten wanneer precies vier vliegen stilstaan. Of: indien minder dan vier vliegen (Y1) zijn stationair op een tijdstip (minuut X), en meer dan vier (Y2) bij de volgende meting tijdstip (minuut X +1), dan lineair interpoleren de ST50 volgens de formule: ST50 = (4 – Y1) / (Y2 – Y1) + X 5. Herhaaldelijke blootstelling aan tolerantie te bepalen Het ontmaskeren van de vliegen Bepaal de ST50 (wt) voor de wild-type controle stam gebruikt in uw experiment. Expose de experimentele groepen vliegt op ethanol zoals hierboven beschreven. Meten hun ST50 (1), maar verder bloot te leggen totdat u bij de tijd 2x ST50 (WT). Terug overdracht de vliegen in een lege flacon voedsel, en houd deze gedurende 4 uur. Opnieuw bloot te leggen de vliegen, en bepaal de ST50 (2) van de blootstelling 2. Bepaal tolerantie Bereken tolerantie in% als (ST50 (2) / ST50 (1) – 1) x100. 6. Representatieve resultaten: Hier ziet, zijn enkele representatieve resultaten die we behaald met 6-8 flacons van vliegen per genotype en de dosis. Als uw standaardfout is aanzienlijk groter, dan is een systematisch probleem is waarschijnlijk opgetreden. Zorg ervoor dat de ethanol gezichten in de belichting kamers, en dat de kamers zijn hetzelfde volume. Figuur 1. Dosis-respons curve van wild type vliegt blootgesteld aan toenemende percentages van ethanol. Acht flesjes van vliegen werden blootgesteld per dosis en geslacht. Mannelijke en vrouwelijke vliegt tonen dezelfde ST50 bij elke dosis (p> 0.22, 2-weg ANOVA), terwijl de ST50 over doses vermindert aanzienlijk met toenemende ethanol dosis (p <0,001). Merk op dat vliegt van overvolle flessen kunnen aanzienlijk kleiner zijn dan die van gezonde flessen, en dit verschil in grootte kan de ST50 beïnvloeden. Seed elke fles met 15-20 vrouwtjes leggen voor 1-2 dagen om een ​​optimale larvale dichtheid per fles te krijgen. Figuur 2. Blootstellen vliegt om ofwel 90%, of 100% ethanol reproduceert de eerder beschreven ethanol-weerstand wordt veroorzaakt door de witte rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-weg ANOVA). Figuur 3. Herhaal de blootstelling aan 100% ethanol, verdeeld door een 4 uur durende herstel interval, veroorzaakt een aanzienlijke toename van ST50 na de tweede opname (p <0,001, gepaarde t-Test). Merk op dat de vliegen werden blootgesteld voor 24 minuten tijdens de eerste blootstelling (komt overeen met twee keer hun na ve ST50). Blootstelling gedurende een kortere tijd (12 minuten) niet leiden tot een significante toename van ST50 na hernieuwde blootstelling (gegevens niet getoond).